甜椒无菌苗培养条件的优化

李妹芳　苗纪忠　卜祥勇等

摘要：以茄门甜椒种子为试材，对无菌苗培养前的种子消毒剂种类及不同消毒时间、浓度等的消毒效果进行了比较研究；对影响无菌苗生长的培养基配方、pH值及生长时间等因素进行了探讨。结果表明，甜椒无菌苗的最佳消毒流程和生长条件为：55℃无菌水浸种15 min，室温静置4～5 h，用10% NaClO消毒30 min，无菌水冲洗3次，接种至1/2MS 培养基+15 g/L蔗糖+7.5 g/L 琼脂，pH值为5.8，（25 ± 1）℃，子叶长出6～10 d左右，即可作为转基因用无菌苗。

关键词：甜椒；无菌苗；生长条件

中图分类号：S641.304+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0034-03

AbstractUsing Qiemen sweet pepper as materials， the disinfection effects of different disinfectant agents， disinfection times and contents on seeds before culture were compared， and the effects of medium formula， pH value and growth time on growth of aseptic seedling were investigated. The results showed that the optimum disinfection method and culture conditions for aseptic sweet pepper seedling were soaking seeds in aseptic water of 55℃ for 15 minutes， then staying at room temperature for 4～5 hours， disinfecting with 10% NaClO for 30 minutes， washing 3 times with aseptic water and then culturing in medium of 1/2MS+15 g/L sugar+7.5 g/L agar with pH value of 5.8 under （25±1）℃. When the cotyledon sprouted for 6～10 days， the seedlings could be used for genetic transformation.

Key wordsSweet pepper； Aseptic seedling； Growth condition

近年来，随着生物技术的快速发展，组培快繁成为甜椒杂交优势固定、优良品种快速繁殖、突变体保存利用及基因转移所必需的有效手段。在组培快繁过程中，有效的消毒程序是获得健壮无菌苗有效开展转基因研究及其它组培试验的基础和关键。国内外研究者对种子的消毒做了许多试验，但药品种类、浓度﹑消毒方法等差异较大，一般用两种以上的消毒剂[1～3]，过程烦琐，污染率高，且多用HgCl2 消毒，无菌苗活力较弱，污染环境，危害人体健康。

我们在利用农杆菌介导法进行甜椒遗传转化的研究中，结合具体的试验条件，应用NaClO对甜椒无菌苗进行消毒处理，优化消毒流程，与文献中普遍采用的HgCl2消毒流程[2]进行了比较试验，并对无菌苗的最佳生长条件进行了探讨。

1材料与方法

1.1供试材料

茄门甜椒种子。选籽粒饱满、颜色正常、大小基本一致的健康种子150 g，每处理50粒种子。

1.2试验设计与方法

1.2.1消毒剂的选择 NaClO消毒程序的优化：NaClO 浓度分别为5%、10%、15%，消毒时间为20、30、40 min，水洗次数为1、2、3、5次的三因素多水平试验。

消毒方法比较：先做两因素处理，无菌水55℃水浴15 min，室温静置4～5 h后，一组用75%酒精进行消毒1～2 min，另一组则不用。每组再分为两组，分别用10%NaClO消毒30 min和0.1%HgCl2 消毒5 min，转到培养基上培养，重复3次。分析无菌苗各生长指标：须根数、苗高、直径、子叶长、下胚轴长、种子萌发率。

1.2.2培养基条件和培养时间的优化培养基为MS和1/2 MS 两个水平；pH值为5.8 和5.5 两个水平；子叶长出3、6、10 d，观察统计分析。重复3次。

1.3培养条件

接种后，在1 600～2 000 lx光照条件下培养16 h，温度为（25±1）℃。

2结果与分析

2.1消毒剂的选择

2.1.1NaClO消毒程序的优化由表1可以看出， 不同浓度和消毒时间，均以10%NaClO消毒30 min处理效果最好，污染率为0，相对萌发率和成苗率均达93.33%。5%NaClO处理消毒效果差，污染率高；消毒40 min处理，甜椒种子颜色雪白，污染率虽不高，但萌发率和成苗率均较低。水洗结果观察显示，用无菌水冲洗1～2 次无菌苗长势相对较弱，冲洗3次无菌苗生长旺盛，因此，以无菌水冲洗3次为宜。

3结论

健壮无菌苗的获得，消毒剂的选择应用非常关键。目前种子的消毒普遍使用0.1%HgCl2为主要消毒剂，但在本试验甜椒无菌苗的培养中，10% NaClO消毒效果优于0.1% HgCl2，染菌率低。另外，合适的消毒方法及培养条件等因素也是获得健壮无菌苗的重要条件。试验表明，获得健壮无菌苗的最佳方案为：选取籽粒饱满、颜色正常、大小基本一致的种子→55℃无菌水水浴15 min→室温静置4～5 h→10%NaClO消毒30 min→无菌水清洗3次→接种至培养基：1/2 MS+15 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂，pH 5.8 →25℃、16 h光照培养，子叶长出6～10 d左右，即可作为组织培养用无菌苗。

参考文献：

[1]Wang Y W， Yang M Z， Pan N S， et al. Plant regeneration and transformation of sweet pepper （Capsicum frutescens）[J]. Acta Bot. Sin. ，1991， 33（10）：780-786.

[2]Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol.Plant，1962，15：473-497.

[3]Kumar A M，Reddy K N，Sreenvathsa R，et al.Towards crop improvement in bell pepper（Capsicum annuum L.）：Transgenics （uid A：：hpt Ⅱ） by a tissue-culture-independent Agrobacterium-mediated in planta approach[J].Scientia Horticulture，2009，119：362-370.山 东 农 业 科 学2014，46（7）：51～54Shandong Agricultural Sciences

摘要：以茄门甜椒种子为试材，对无菌苗培养前的种子消毒剂种类及不同消毒时间、浓度等的消毒效果进行了比较研究；对影响无菌苗生长的培养基配方、pH值及生长时间等因素进行了探讨。结果表明，甜椒无菌苗的最佳消毒流程和生长条件为：55℃无菌水浸种15 min，室温静置4～5 h，用10% NaClO消毒30 min，无菌水冲洗3次，接种至1/2MS 培养基+15 g/L蔗糖+7.5 g/L 琼脂，pH值为5.8，（25 ± 1）℃，子叶长出6～10 d左右，即可作为转基因用无菌苗。

关键词：甜椒；无菌苗；生长条件

中图分类号：S641.304+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0034-03

AbstractUsing Qiemen sweet pepper as materials， the disinfection effects of different disinfectant agents， disinfection times and contents on seeds before culture were compared， and the effects of medium formula， pH value and growth time on growth of aseptic seedling were investigated. The results showed that the optimum disinfection method and culture conditions for aseptic sweet pepper seedling were soaking seeds in aseptic water of 55℃ for 15 minutes， then staying at room temperature for 4～5 hours， disinfecting with 10% NaClO for 30 minutes， washing 3 times with aseptic water and then culturing in medium of 1/2MS+15 g/L sugar+7.5 g/L agar with pH value of 5.8 under （25±1）℃. When the cotyledon sprouted for 6～10 days， the seedlings could be used for genetic transformation.

Key wordsSweet pepper； Aseptic seedling； Growth condition

近年来，随着生物技术的快速发展，组培快繁成为甜椒杂交优势固定、优良品种快速繁殖、突变体保存利用及基因转移所必需的有效手段。在组培快繁过程中，有效的消毒程序是获得健壮无菌苗有效开展转基因研究及其它组培试验的基础和关键。国内外研究者对种子的消毒做了许多试验，但药品种类、浓度﹑消毒方法等差异较大，一般用两种以上的消毒剂[1～3]，过程烦琐，污染率高，且多用HgCl2 消毒，无菌苗活力较弱，污染环境，危害人体健康。

我们在利用农杆菌介导法进行甜椒遗传转化的研究中，结合具体的试验条件，应用NaClO对甜椒无菌苗进行消毒处理，优化消毒流程，与文献中普遍采用的HgCl2消毒流程[2]进行了比较试验，并对无菌苗的最佳生长条件进行了探讨。

1材料与方法

1.1供试材料

茄门甜椒种子。选籽粒饱满、颜色正常、大小基本一致的健康种子150 g，每处理50粒种子。

1.2试验设计与方法

1.2.1消毒剂的选择 NaClO消毒程序的优化：NaClO 浓度分别为5%、10%、15%，消毒时间为20、30、40 min，水洗次数为1、2、3、5次的三因素多水平试验。

消毒方法比较：先做两因素处理，无菌水55℃水浴15 min，室温静置4～5 h后，一组用75%酒精进行消毒1～2 min，另一组则不用。每组再分为两组，分别用10%NaClO消毒30 min和0.1%HgCl2 消毒5 min，转到培养基上培养，重复3次。分析无菌苗各生长指标：须根数、苗高、直径、子叶长、下胚轴长、种子萌发率。

1.2.2培养基条件和培养时间的优化培养基为MS和1/2 MS 两个水平；pH值为5.8 和5.5 两个水平；子叶长出3、6、10 d，观察统计分析。重复3次。

1.3培养条件

接种后，在1 600～2 000 lx光照条件下培养16 h，温度为（25±1）℃。

2结果与分析

2.1消毒剂的选择

2.1.1NaClO消毒程序的优化由表1可以看出， 不同浓度和消毒时间，均以10%NaClO消毒30 min处理效果最好，污染率为0，相对萌发率和成苗率均达93.33%。5%NaClO处理消毒效果差，污染率高；消毒40 min处理，甜椒种子颜色雪白，污染率虽不高，但萌发率和成苗率均较低。水洗结果观察显示，用无菌水冲洗1～2 次无菌苗长势相对较弱，冲洗3次无菌苗生长旺盛，因此，以无菌水冲洗3次为宜。

3结论

健壮无菌苗的获得，消毒剂的选择应用非常关键。目前种子的消毒普遍使用0.1%HgCl2为主要消毒剂，但在本试验甜椒无菌苗的培养中，10% NaClO消毒效果优于0.1% HgCl2，染菌率低。另外，合适的消毒方法及培养条件等因素也是获得健壮无菌苗的重要条件。试验表明，获得健壮无菌苗的最佳方案为：选取籽粒饱满、颜色正常、大小基本一致的种子→55℃无菌水水浴15 min→室温静置4～5 h→10%NaClO消毒30 min→无菌水清洗3次→接种至培养基：1/2 MS+15 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂，pH 5.8 →25℃、16 h光照培养，子叶长出6～10 d左右，即可作为组织培养用无菌苗。

参考文献：

[1]Wang Y W， Yang M Z， Pan N S， et al. Plant regeneration and transformation of sweet pepper （Capsicum frutescens）[J]. Acta Bot. Sin. ，1991， 33（10）：780-786.

[2]Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol.Plant，1962，15：473-497.

[3]Kumar A M，Reddy K N，Sreenvathsa R，et al.Towards crop improvement in bell pepper（Capsicum annuum L.）：Transgenics （uid A：：hpt Ⅱ） by a tissue-culture-independent Agrobacterium-mediated in planta approach[J].Scientia Horticulture，2009，119：362-370.山 东 农 业 科 学2014，46（7）：51～54Shandong Agricultural Sciences

摘要：以茄门甜椒种子为试材，对无菌苗培养前的种子消毒剂种类及不同消毒时间、浓度等的消毒效果进行了比较研究；对影响无菌苗生长的培养基配方、pH值及生长时间等因素进行了探讨。结果表明，甜椒无菌苗的最佳消毒流程和生长条件为：55℃无菌水浸种15 min，室温静置4～5 h，用10% NaClO消毒30 min，无菌水冲洗3次，接种至1/2MS 培养基+15 g/L蔗糖+7.5 g/L 琼脂，pH值为5.8，（25 ± 1）℃，子叶长出6～10 d左右，即可作为转基因用无菌苗。

关键词：甜椒；无菌苗；生长条件

中图分类号：S641.304+.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0034-03

AbstractUsing Qiemen sweet pepper as materials， the disinfection effects of different disinfectant agents， disinfection times and contents on seeds before culture were compared， and the effects of medium formula， pH value and growth time on growth of aseptic seedling were investigated. The results showed that the optimum disinfection method and culture conditions for aseptic sweet pepper seedling were soaking seeds in aseptic water of 55℃ for 15 minutes， then staying at room temperature for 4～5 hours， disinfecting with 10% NaClO for 30 minutes， washing 3 times with aseptic water and then culturing in medium of 1/2MS+15 g/L sugar+7.5 g/L agar with pH value of 5.8 under （25±1）℃. When the cotyledon sprouted for 6～10 days， the seedlings could be used for genetic transformation.

Key wordsSweet pepper； Aseptic seedling； Growth condition

近年来，随着生物技术的快速发展，组培快繁成为甜椒杂交优势固定、优良品种快速繁殖、突变体保存利用及基因转移所必需的有效手段。在组培快繁过程中，有效的消毒程序是获得健壮无菌苗有效开展转基因研究及其它组培试验的基础和关键。国内外研究者对种子的消毒做了许多试验，但药品种类、浓度﹑消毒方法等差异较大，一般用两种以上的消毒剂[1～3]，过程烦琐，污染率高，且多用HgCl2 消毒，无菌苗活力较弱，污染环境，危害人体健康。

我们在利用农杆菌介导法进行甜椒遗传转化的研究中，结合具体的试验条件，应用NaClO对甜椒无菌苗进行消毒处理，优化消毒流程，与文献中普遍采用的HgCl2消毒流程[2]进行了比较试验，并对无菌苗的最佳生长条件进行了探讨。

1材料与方法

1.1供试材料

茄门甜椒种子。选籽粒饱满、颜色正常、大小基本一致的健康种子150 g，每处理50粒种子。

1.2试验设计与方法

1.2.1消毒剂的选择 NaClO消毒程序的优化：NaClO 浓度分别为5%、10%、15%，消毒时间为20、30、40 min，水洗次数为1、2、3、5次的三因素多水平试验。

消毒方法比较：先做两因素处理，无菌水55℃水浴15 min，室温静置4～5 h后，一组用75%酒精进行消毒1～2 min，另一组则不用。每组再分为两组，分别用10%NaClO消毒30 min和0.1%HgCl2 消毒5 min，转到培养基上培养，重复3次。分析无菌苗各生长指标：须根数、苗高、直径、子叶长、下胚轴长、种子萌发率。

1.2.2培养基条件和培养时间的优化培养基为MS和1/2 MS 两个水平；pH值为5.8 和5.5 两个水平；子叶长出3、6、10 d，观察统计分析。重复3次。

1.3培养条件

接种后，在1 600～2 000 lx光照条件下培养16 h，温度为（25±1）℃。

2结果与分析

2.1消毒剂的选择

2.1.1NaClO消毒程序的优化由表1可以看出， 不同浓度和消毒时间，均以10%NaClO消毒30 min处理效果最好，污染率为0，相对萌发率和成苗率均达93.33%。5%NaClO处理消毒效果差，污染率高；消毒40 min处理，甜椒种子颜色雪白，污染率虽不高，但萌发率和成苗率均较低。水洗结果观察显示，用无菌水冲洗1～2 次无菌苗长势相对较弱，冲洗3次无菌苗生长旺盛，因此，以无菌水冲洗3次为宜。

3结论

健壮无菌苗的获得，消毒剂的选择应用非常关键。目前种子的消毒普遍使用0.1%HgCl2为主要消毒剂，但在本试验甜椒无菌苗的培养中，10% NaClO消毒效果优于0.1% HgCl2，染菌率低。另外，合适的消毒方法及培养条件等因素也是获得健壮无菌苗的重要条件。试验表明，获得健壮无菌苗的最佳方案为：选取籽粒饱满、颜色正常、大小基本一致的种子→55℃无菌水水浴15 min→室温静置4～5 h→10%NaClO消毒30 min→无菌水清洗3次→接种至培养基：1/2 MS+15 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂，pH 5.8 →25℃、16 h光照培养，子叶长出6～10 d左右，即可作为组织培养用无菌苗。

参考文献：

[1]Wang Y W， Yang M Z， Pan N S， et al. Plant regeneration and transformation of sweet pepper （Capsicum frutescens）[J]. Acta Bot. Sin. ，1991， 33（10）：780-786.

[2]Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol.Plant，1962，15：473-497.

[3]Kumar A M，Reddy K N，Sreenvathsa R，et al.Towards crop improvement in bell pepper（Capsicum annuum L.）：Transgenics （uid A：：hpt Ⅱ） by a tissue-culture-independent Agrobacterium-mediated in planta approach[J].Scientia Horticulture，2009，119：362-370.山 东 农 业 科 学2014，46（7）：51～54Shandong Agricultural Sciences