NF-κB在肝癌介入治疗后癌旁肝细胞中的表达

张 靓，杜 伟

（大理学院附属医院，云南大理 671000）

原发性肝癌（Hepatic carcinoma）是我国高发的恶性肿瘤之一，临床发现肝癌的发病例呈逐年上升趋势。针对该肿瘤的治疗方法有：生物靶向治疗、开腹手术以及放化疗等。介入手术是目前在疾病诊断与治疗中的一种微创治疗方法〔1〕，肝癌的介入治疗是通过导管向肿瘤组织靶血管进行化疗栓塞，针对小肝癌（＜3 cm）疗效良好，也适用于巨型肝癌，经过多次栓塞化疗后瘤体积缩小，作为后期手术切除的辅助性治疗。但目前临床发现部分患者在介入治疗后出现肝功能异常，甚至肝衰竭死亡〔2-3〕。

在多种肿瘤如胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌等肿瘤组织中均发现NF-кB的高表达〔4〕。表明NF-кB活化在肿瘤侵袭及转移起到关键的作用。同时NF-кB作为人体细胞内的一类重要的核转录调控因子，现研究已表明NF-кB与免疫反应、炎症和急性反应、细胞增殖与凋亡、病毒感染等多种病理过程有一定的相关性〔5-6〕。1986年Sen等最早发现NF-кB（nuclear factor-кB）〔2〕一种重要的转录调控因子，广泛存在于真核细胞中。本研究建立动物肝癌模型行TACE治疗，研究NF-кB在肿瘤及癌旁组织中的表达。

1 材料

1.1 实验动物 成功建立肝癌模型59例，见图1。A组共29例，B组30例，种植后3周时行CT扫描（平扫+增强）以及肝动脉化疗栓塞（TACE）治疗术，经CT、MRI及数字减影血管造影（DSA）检查后，证实种植成功30例，见图2～4。C组（对照组）为20例，CT定位肝穿刺后注射生理盐水。

图1 兔VX2肝癌模型大体，可见病灶呈白色鱼肉样改变，病灶局限，为典型的兔原发性肝癌模型

图2 兔VX2肝癌模型CT平扫及增强扫描，可见肿瘤组织呈低密度，中心密度更低，边缘强化

图3 兔VX2肝癌模型MRI平扫及增强扫描，T1WI为低信号，T2WI为高信号，中央可见低信号坏死区

图4 兔VX2肝癌模型DSA显示肿瘤供血动脉增多，肿瘤组织染色

1.2 主要试剂 NF-кB鼠抗兔多克隆抗体（购于武汉博士德）、二抗（抗鼠/兔）试剂及DAB显色试剂（购于Dako公司）等。

2 方法

2.1 实验动物分组 A组（肝癌组）29只，B组（介入治疗组）30只，B组于肿瘤种植后3周左右行CT确定肿瘤位置，后行TACE术治疗，TACE治疗后约10小时取材，对照组取材时间一致。

2.2 取材及石蜡包埋及HE染色 组织经过固定后进行石蜡包埋，切片（厚度为4 um），行苏木精—伊红染色（HE）。

2.3 免疫组织化学染色 采用Envision TM二步免疫组化法，具体步骤参见博士德免疫组化说明书。

2.4 判断标准 NF-кB主要在细胞浆内阳性表达〔7〕，颜色分别呈黄色、棕黄色、棕褐色。每张切片选取10个视野（400倍镜下），按阳性细胞数和颜色深度来判定：①阳性细胞：0分（＜5%），1分（5%～24%），2分（25%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）；②颜色深度：0分（无着色），1分（淡黄色），2分（黄棕色），3分（棕褐色）。

再通过阳性细胞数以及染色深度评分相加之和判定结果：＜2分阴性（-），2～3分弱阳（+），4～5分阳性（++），6～7分强阳性（+++）。

2.5 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行分析，采用未矫正χ2检验，P＜0.05差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 HE染色 肿瘤细胞梁索状分布，细胞核增大明显，核深染。肿瘤部分区域可见坏死，大量炎性细胞以及菌团，A组癌旁肝细胞有轻度脂肪变性以及可见少量凋亡细胞。B组癌旁组织内可见大量炎性细胞浸润，以中性粒、单核细胞为主，同时也可见肝细胞脂肪变，以及凋亡细胞。

3.2 NF-кB的免疫组织化学检测 免疫组化分肿瘤组癌组织为A1，癌旁组织为A2，介入治疗组肿瘤组织为B1，癌旁组织为B2，对照组为C。

A1组29例肿瘤组织内，NF-кB阳性表达者21例，阳性率为72.4%，相应的A2组阳性表达为11例，阳性率为37.9%；B1组阳性表达共24例，阳性率为82.4%，B2组阳性表达18例，阳性率60%。C组仅2例为阳性表达，阳性率为10%，各组与对照比较，除A2外差异具有统计学意义（P＜0.05），A2与C组比较P ＞0.05，A1、B1、A2、B2两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5～14。

图5 正常肝组织HE染色（×100）

图6 正常肝细胞组HE染色（×400）

图7 VX2肿瘤组织HE染色（×40）

图8 VX2肿瘤HE染色（×400）

图9 NF-кB在VX2肝癌组织中的表达（×100）

图10 NF-кB在VX2肝癌组织中的表达（×400）

图11 NF-кB在VX2肝癌组织中的表达（强阳性）（×400）

图12 TACE治疗VX2肝癌后，NF-кB在肝癌组织中的表达（×400）

图13 NF-кB在瘤旁肝组织中的表达（×400）

图14 TACE治疗VX2肝癌后，NF-кB在瘤旁肝组织中的表达（×400）

A1组29例肿瘤组织内，NF-кB表达。见表1～2。

表1 NF-кB分别在肝癌组织、癌旁组织与正常肝组织的表达情况比较

表1所示，A2及C组比较，组间差异无统计学意义。而A1，B1，B2三组与C组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 肝癌组织以及癌旁组织内NF-кB表达

经过TACE治疗后，肿瘤组织和癌旁肝组织内的NF-кB表达均增高，TACE术前后肿瘤组织中NF-кB表达差异无统计学意义（P ＞0.05），而癌旁肝组织NF-кB表达明显增高。

4 讨论

本次研究中免疫组化检测结果显示HCC癌组织NF-кB表达明显升高，表明NF-кB与肝癌有一定的相关性。C组与A1组组间统计不具有统计学意义，说明原发性肝癌癌旁组织有一定代偿。实验研究证明造影剂和化疗药物如阿霉素、长春新碱、顺铂等均可以诱导NF-кB活化〔7-8〕。

本实验免疫组化结果显示癌组织中NF-кB表达高于癌旁组织，表明NF-кB与肝癌的发生以及发展有一定相关性，TACE治疗后，癌旁肝组织NF-кB表达升高更为明显，可能机制为：介入手术栓塞以及化疗后导致肝细胞凋亡、炎性反应，激活NF-кB〔9-10〕。

TACE术后癌旁组织阳性率为60.0%，未行介入治疗的癌旁组织阳性率为37.9%。TACE术后肿瘤旁肝组织内NF-кB活性增高明显，造影剂以及化疗药物对肝细胞造成损伤，栓塞导致癌旁组织缺血，产生炎性反应，导致 NF-кB 表达增高〔11-14〕。TACE治疗前后肝癌组织NF-кB的表达未见明显差异，其机制可能是TACE术后肿瘤细胞被抑制〔15〕，细胞活性被抑制导致NF-кB抑制蛋白IКB的表达增加，IКB与NF-кB的亲和力明显大于其与DNA的亲和力，与NF-кB结合后，抑制NF-кB的蛋白表达，抵消部分导致的NF-кB的活性表达增高的因素〔16〕。

〔1〕杜伟，袁贵斌，汪永平，等.介入法植入国产支架治疗前列腺增生症的临床应用〔J〕.大理学院学报，2010，9（2）:47-49.

〔2〕王守峰，张金岭，殷忠美，等.不同Child分级的高HBVDNA滴度原发性肝癌介入治疗后肝功能损害的对比研究〔J〕.中国肿瘤外科杂志，2013，5（3）：160-162.

〔3〕独建库，李冠海，张明德，等.肝癌1063例介入治疗并发症处理的研究〔J〕.临床军医杂志，2011，39（3）:491-493.

〔4〕SEN R，BALTIMORE D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer Sequences〔J〕.Cell，1986，46（5）:705-716.

〔5〕AMEYA PARANJPE，KALKUNTE S，SRIVENUGOPAL.Degradation of NF-κB，p53 and other regulatory redoxsensitive proteins by thiolconjugating and nitrosylating drugs in human tumor cells〔J〕.Carcinogenesis，2013，34（5）:990-1000.

〔6〕范伟，刘朝晖，张溪林，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌中NF-кB 通路的研究〔J〕.中国医学创新，2012，9（18）:15-17.

〔7〕AMIRI K I，RICHMOND A.Role of nuclear factor-kappa B in melanoma〔J〕.Cancer Metastasis Rev，2005，24:301-313.

〔8〕KALALTZIDIS D，GILMORE T D.Transcription factor cross-talk:the estrogen receptor and NF-kappa B〔J〕.Trends Endocrinol Metab，2005，16:46-52.

〔9〕HUAN DENG，ZHENZHEN ZHOU，WEI TU，et al.AEG1 induces COX-2 expression via activation of NF-κB and AP-1 in hepatoma HepG2 cells〔J〕.Chinese-German J Clin Oncol，2013，12（6）:253-256.

〔10〕KUO M T，LIU Z，WEI Y，et al.Induction of human MDRl gene expression by 2-acelylaminofluoxene is mediated by effectors of the phosphoinositide 3-kinase Pathway that activate NF-kappa signaling〔J〕.Oncogene，2002，21（13）:1945-1954.

〔11〕齐京鹏，廖和和，王永峰，等.不能手术的原发性肝癌介入治疗与介入加放疗的疗效比较〔J〕.现代肿瘤医学，2011，19（3）:528-530.

〔12〕陈爱云.原发性肝癌介入手术治疗40例围术期护理〔J〕.齐鲁护理杂志，2012，18（20）:66-67.

〔13〕康建荣.75例肝癌介入术后并发症的观察及护理〔J〕.中国实用医药，2012，7（7）:216-217.

〔14〕杨玉琴.膀胱癌术后化疗灌注的体会〔J〕.大理学院学报，2012，11（12）:72-73.

〔15〕LAVON I，PIKARSKY E，GUTKOVICH E，et a1.Nuclear fator-kappaB Protects the liver against genotoxic stress and functions independently of p53〔J〕.Cancer Res，2003，63（1）:25-30.

〔16〕AE-RI N，KATINKA P Z，PAUL P T，et al.Non-canonical NF-кB signaling in endothelial cells may enhance synovial inflammation by stimulating angiogenesis〔J〕.Journal of Translational Medicine，2011，9（2）:50.