汉防已甲素对内源性神经干细胞增殖分化影响的前瞻性研究

罗春山，邓忠良，邱冰，李青，王远政，陆庭盛，姚书丹

（重庆医科大学第二附属医院 骨科，重庆 400010）

汉防已甲素对内源性神经干细胞增殖分化影响的前瞻性研究

罗春山，邓忠良Δ，邱冰，李青，王远政，陆庭盛，姚书丹

（重庆医科大学第二附属医院 骨科，重庆 400010）

目的探讨汉防己甲素(tetrandrine，Tet)对大鼠急性脊髓损伤(acute spinal cord injury，ASCI)后脊髓损伤段内源性神经干细胞(endogenous neural stem cells，ENSCs)增殖分化的影响。方法选用 78 只大鼠，随机分为 3 组：损伤对照组(n=36)，Tet组(n=36)，假手术组(n=6)。损伤组、Tet组采用 Allen’s打击法造模，Tet组于脊髓损伤后30 min、术后24 h、术后48 h给予Tet 22．5 mg/kg体重治疗，损伤组注射同等剂量的生理盐水。于脊髓损伤后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w、4 w取损伤段脊髓组织，HE染色观察脊髓组织的形态结构变化，免疫荧光组织化学方法检测各组大鼠脊髓组织在不同时间段巢蛋白（Nestin）及BrdU的表达变化情况。结果ASCI后HE染色显示Tet组脊髓组织损伤较损伤组轻；ASCI后1d损伤对照组及Tet组均可见少量Nestin表达阳性细胞及BrdU表达阳性细胞，ASCI后1 w对照组及Tet组可见大量阳性细胞，阳性细胞表达达高峰，持续至2 w后逐渐开始下降，ASCI后4 w时，Tet组、损伤对照组中BrdU及Nestin阳性细胞表达数明显减少，较假手术组高，但无统计学差异。Tet组BrdU阳性细胞数量和Nestin阳性细胞数量在各时间点均高于损伤对照组，其中术后 1 d、3 d、1 w、2 w、3 w 差异具有统计学意义（P＜0．05），术后 4 w 2 者阳性细胞数比较无统计学意义。损伤对照组及 Tet组在 ASCI后 1 d、3 d、1 w、2 w、3 w时，与假手术组相比，BrdU、Nestin阳性细胞数量差异有统计学意义（P＜0．05）。损伤对照组及 Tet组在 ASCI后 1 d、3 d、1 w、2 w、3 w 时 BrdU、Nestin阳性细胞数量差异有统计学意义（P＜0．05）。结论Tet可通过改善微环境增加BrdU、Nestin阳性细胞，增加ENSCs的增殖，有利于神经功能的恢复。

汉防己甲素；脊髓损伤；内源性神经干细胞

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 改良Allen垂直下落打击器：10 g砝码；直径0.8 cm的刻度管，作为打击通道；直径4 mm的薄金属片；5-溴2-脱氧嘧啶尿苷、5-溴2-脱氧嘧啶尿苷抗体-3(BrdU Ab-3)购自上海西唐生物科技有限公司；免疫荧光二抗试、FITC标记二抗、免疫组化湿盒、Nestin多克隆抗体、DAB显色试剂盒(购自武汉博士德)；Tet(纯度＞99.9%)购自江西彭泽制药厂，配置成浓度为2 g/L的溶液，过滤灭菌后备用。

1.2 实验动物分组 SPF级SD大鼠，体重200～300 g，78只，雌雄不限，购自贵阳医学院动物实验中心，动物许可证号：SCXK（黔）2012--001。随机分为3组：假手术组6只，损伤对照组36只，Tet治疗组36只。

1.3 脊髓损伤模型建立 用4%戊巴比妥钠麻醉溶液40 mg/kg行腹腔麻醉成功后，四肢与牙齿固定于鼠台上，手术区剪毛备皮，碘伏消毒后铺无菌洞巾，以胸9棘突为中心取后背部正中切口，长约1.5 cm，逐层切开皮肤、皮下，用神经剥离子沿棘突两旁剥离开椎旁肌，眼科镊提起棘突以便增加椎板间隙，显微剪剪除胸8、9、10椎板，造成0.4 cm×1.0 cm的椎板缺损，显露硬膜囊。B、C、D组大鼠把直径4 mm的薄金属片置于胸9段脊髓处，按加速压迫型Allen’s打击法制成脊髓损伤模型，砝码重量10 g，沿直径0.8 cm的刻度试管从5 cm高处自由落下致伤大鼠，可见损伤处脊髓充血明显、造成脊髓损伤后全瘫模型。损伤对照组、Tet治疗组制造全瘫模型，假手术组大鼠切除椎板后不行打击损伤，直接缝合。

将1%的5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridines，BrdU）生理盐水溶液在每次处死大鼠前48 h、36 h、24 h开始以50 mg/（kg体重/次）的剂量进行腹腔注射BrdU，以标记脊髓内保持分化活力的细胞，第3次给药后24 h处死大鼠取标本。Tet治疗组于制模术后30 min、伤后24 h、伤后48 h尾静脉注射浓度为2 g/L的Tet溶液，按22.5 mg/Kg体重，损伤对照组注入同等剂量的生理盐水作为对照。

1.4 标本采集 假手术组动物于饲养28 d后处死，Tet组及损伤对照组动物分别于术后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w、4 w每时间点随机取6只大鼠处死。4%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉成功后，固定于鼠台；剪开胸骨打开胸腔经左心室心尖处往主动脉插管并固定好，快速滴注4℃生理盐水200 mL，打开右心耳见清凉液体流出；用灌注泵向主动脉灌注4℃的4%多聚甲醛磷酸缓冲液200 mL，持续1 h，让组织固定后取材；从原手术切口打开暴露损伤段脊髓，取损伤段脊髓约6 mm，取出标本后反复用生理盐水冲洗，PBS液中浸泡冲洗3次，每次5 min，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH=7.4）内固定12 h后；梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、100%)脱水；使用二甲苯透明；组织块在石蜡中包埋；修剪边缘平齐后，沿脊髓横切面切片，制备厚度为3μ m的组织切片；贴片、烤片。备用于HE染色和内源性神经干细胞的Nestin和BrdU免疫荧光组化检测。

1.5 HE染色 在每个时间点每只大鼠取2张组织切片行HE染色，切片脱蜡后清洗、苏木素染色、洗去片上多余染液，1%盐酸酒精浸泡分色、碱性溶液促蓝后流水冲洗，伊红复染、梯度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。奥林巴斯光学显微镜下观察脊髓组织的结构形态变化。

1.6 免疫组织化学染色及图像分析 每个标本取2张完整的组织切片，每组各个时间点共12张组织切片进行BrdU、Nestin免疫组化染色，阴性对照用正常羊血清替代一抗。封片后镜检并照相。奥林巴斯免疫组织化学染色BX-50观察组织切片，BrdU免疫组织化学染色以细胞内出现棕褐色颗粒为阳性表达，Nestin免疫组织化学染色以胞浆均匀染色呈棕色或褐色为阳性表达，图像分析由未参与实验的2名实验人员实行，在200倍的光学显微镜下对脊髓损伤区进行拍照，计算每张切片随机选取5个不重叠视野的BrdU阳性表达细胞数，取其平均值作为每一切片的阳性细胞数值。

1.7 统计学方法 所得数据均经过SPSS 13.0统计软件进行统计分析，正态计量数据以“±s”表示，各组之间及组内不同时间点之间的两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型制作情况 3只大鼠术后伤口感染后死亡，损伤对照组、Tet组共有8只大鼠死亡。术后双下肢瘫痪是打击模型成功的标准，假手术组无明显神经功能障碍。

2.2 HE染色结果

假手术组的脊髓组织HE染色正常，未见出血坏死及组织水肿等表现；损伤对照组可见损伤脊髓组织8 h开始出现片状出血、水肿，1 d时组织呈中重度水肿及神经元开始变性，1 w时可见大量神经元变性，灰白质有微小空腔形成，4 w时灰白质中出现坏死后形成的囊腔，少量神经元残留；Tet组损伤脊髓组织8 h呈轻度水肿，少量出血，1 d时神经元轻中度肿胀，少量神经元变性，1 w时组织肿胀开始消退，留有少量点状坏死灶，4 w组织肿胀基本消退，少量坏死后形成小囊腔，大量神经元残留(见图1)

图1 损伤对照组与Tet组1 w、4 w HE染色结果（×100）Fig.1 HE staining of control group and Tet-treated group in one week，four weeks after injury(×100)

2.3 脊髓损伤后BrdU阳性细胞的变化 BrdU染色阳性细胞呈椭圆形、圆形或梭形，阳性细胞呈黄褐色染色，形态多样。各组不同时间点脊髓组织中BrdU染色阳性细胞形态、大小、染色深浅无明显差异。经脊髓横截面不同区域观察发现BrdU染色阳性细胞主要集聚于脊髓中央管周围和灰质内。ASCI后1 d即可见少量BrdU阳性细胞，随时间推移不断增加，到ASCI后1 w时BrdU阳性细胞数达高峰，损伤对照组及Tet治疗组可见大量阳性细胞，持续2 w后逐渐下降，分布于损伤区周围及脊髓中央管周围，ASCI后4 w BrdU阳性细胞数明显减少，但仍高于假手术组。损伤对照组及Tet组在ASCI后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w时与假手术组相比BrdU阳性细胞数量差异有统计学意义，ASCI后到第4 w Tet组、损伤对照组数值较假手术组高，但2组BrdU阳性细胞数量差异无统计学意义。Tet治疗组BrdU阳性细胞数量高于损伤组，损伤对照组及Tet组在ASCI后1天时BrdU染色阳性细胞数量有增加，但2组差异无统计学意义，2组ASCI后在1 d、3 d、3 w时间点BrdU阳性细胞数量差异有统计学意义，2组ASCI后在1 w、2 w时BrdU阳性细胞数量差异有统计学意义，ASCI后到第4周Tet组数值较损伤组高，但2组BrdU阳性细胞数量差异无统计学意义(见表1、图2)。

表1 损伤组织中brdU免疫组化染色阳性细胞计数结果Tab.1 Counting results for the number of brdU positive cells by immunohistochemical staining

图2 脊髓损伤后BrdU阳性细胞变化情况（×200）Fig.2 Results of brdU positive cells in control group and Tet-treated group after injury(×200)

2.4 脊髓损伤后Nestin阳性细胞的变化 Nestin阳性细胞胞核淡染，胞浆深染，呈三角形、梭形或卵圆形。假手术组中可见少量的Nestin阳性细胞。ASCI后1 d时即可见Nestin阳性细胞数增加，随时间推移逐渐增加，ASCI后1 w Nestin阳性细胞数达高峰，损伤对照组及Tet治疗组可见大量阳性细胞，持续2 w后逐渐下降，ASCI后4 w Nestin阳性细胞数明显减少，但仍高于假手术组。损伤对照组及Tet组在术后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w时与假手术组相比Nestin阳性细胞数量差异有统计学意义。Tet治疗组表达数量高于损伤组，2组术后在1 d、3 d、1 w、2 w、3 w时Nestin阳性细胞数量差异有统计学意义，术后到第4周时2组Nestin阳性细胞数量差异无统计学意义(见表2、图3)。

表2 损伤组织中nestin免疫组化染色阳性细胞计数结果Tab.2 Counting results for the number of nestin positive cells by immunohistochemical staining

图3 脊髓损伤后Nestin细胞染色结果Fig.3 Results of Nestin positive cells after injury

3 讨论

ASCI后原发性和继发性损伤的序贯进行，导致出现脊髓微循环障碍、自由基损伤、脂质过氧化损伤，免疫炎症反应等病理现象，引起神经元大量变性、坏死致神经传导通路的中断，最终导致瘫痪等严重的神经功能障碍。既往已有大量实验用神经干细胞来治疗修复脊髓损伤取得了一些进展，但仍存在着很多诸如社会学、论理学、污染、免疫排斥、分化方向控制、致瘤性等问题[4]。

在成年哺乳动物的中枢神经系统中存在ENSCs等前体细胞已在近年来的研究中证实，并认为成年哺乳动物脊髓组织中ENSCs主要存在脊髓损伤区室管膜周围、膜下区，在某些病理变化、外伤刺激及炎症性细胞因子的刺激下可激活、增殖分化和迁移[2-3，5-6]。ENSCs来自自身，方便可靠，无免疫排斥反应、亦无致瘤性之忧。很多实验发现将ENSC分离至体外培养时表现出多能分化的特点，能分化为神经元，但移植至脊髓后部分神经干细胞出现死亡或分化成为形成胶质的星型胶质细胞，而不是分化成为有功能的神经元细胞，可能是脊髓损伤后局部微环境的改变，大量神经毒性物质如 NOS、TNF-α、IL-1 β、IL-6、骨形态发生蛋白等积聚导致神经干细胞的死亡或分化为星形胶质细胞[7-8]。研究发现内源性神经干细胞非常脆弱，脊髓损伤后大部分死亡，剩下的被激活，分化增殖参与损伤的修复[9]。但实验证明通过干预因素可促进ENSC增殖分化[10-11]，因此大量研究试想通过人为的干预因素早期竞争性地抑制负性因素，改善微环境，使神经增殖维持时限长、数量最大化，同时促进神经干细胞向神经元方向分化，使这些种子细胞能真正参与损伤的修复，促进功能的恢复，已取得了一些正面的成果。本实验试想利用Tet具有的特殊药理特性通过改善ASCI后局部微环境来促进ENSCs增殖分化，以利于修复损伤的脊髓功能[12-13]。

胸腺嘧啶是DNA的基本成分，Brdu是胸腺嘧啶的类似替代物物，在DNA合成期（S期）过程中可被利用替代胸腺嘧啶，BrdU标记阳性细胞就是新生细胞，可作为细胞分裂增殖的示踪剂[14]。有研究证实BrdU标记阳性细胞90%是具有分化能力的神经干细胞，只有10%是已分化细胞，具有很高的特异性[15]。BrdU注入体内后可很快整合到新生DNA中，本实验在处死大鼠前48 h、36 h、24 h给予腹腔注射Brdu，让其有充足时间吸收，在这一时期有分化潜能的细胞进行增殖分裂活动，可吸收BrdU替代到新的DNA链中，利用免疫组化染色和荧光素作为指示系统可检测出含有Brdu的细胞，根据Brdu标记增殖细胞数量、位置可分析其被激活的ENSCs的增殖速度和在组织中迁徙的路径，并可追踪到增殖分裂的子代细胞。本实验观察的是ASCI后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w、4 w各时间点损伤脊髓组织中前1 d(ASCI后1 d组织采集的标本)或前2 d的ENSCs的增殖细胞数，因此选择大鼠处死前2 d给药。

巢蛋白(Nestin)是一种中间丝蛋白，分布在细胞胞浆中，存在于成年多能干神经前体细胞或神经干细胞中，系未分化状态多能神经干细胞的特异性标记抗原蛋白，，目前检测巢蛋白表达水平是鉴定神经干细胞最重要、最常用的手段之一。在中枢神经系统发育过程中，Nestin表达较高，在成熟的中枢神经系统中，Nestin表达非常低，当中枢神经系统受损伤时，局部微环境改变刺激神经干细胞增殖分化，Nestin表达升高，并在细胞因子的趋化作用下可发生迁徙，异位表达Nestin，距损伤区越近，Nestin阳性细胞数越多，距损伤区越远，Nestin阳性细胞数越少[16]。

本实验观察到在正常脊髓组织中Nestin阳性细胞数量较少，主要集中存在于室管膜周围，同时在脊髓的灰质和白质中也少见。ASCI后1 d可见Nestin阳性细胞表达增多，位于室管膜区及脊髓损伤区，ASCI后1 w时可见Nestin阳性细胞较密集，Nestin阳性细胞数值达高峰，主要集中位于中央管室管膜周围及脊髓损伤区，持续高表达2 w后逐渐下降，4 w后表达明显减少，BrdU标记阳性细胞数值检测也有相同的规律，说明在ASCI能激活ENSCs，使处于G0期的ENSCs进入细胞周期，处于活跃的增殖分化状态，增殖的ENSCs大量表达Nestin和进行BrdU标记，有一个被激活、增殖分化达高峰、随着损伤内环境的稳定又逐渐下降的过程。同时损伤后ENSCs活化并在细胞因子的趋化作用下移行至脊髓损伤区，分化形成新的神经元修复损伤脊髓组织。Tet组Nestin阳性细胞数值和BrdU标记阳性细胞数值在相同时间点明显高于损伤组，说明Tet能使更多的ENSCs增殖分化，并积聚到损伤区域内，为损伤组织修复提供更多的种子细胞，其机制可能是通过改善脊髓损伤后局部微环境，如减轻局部炎症反应、抗脂质过氧化、稳定生物膜性结构、改善损伤区微循环障碍、防止Ca2+过度内流所致的该超载等有关[17]。

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Experimental study of tetrandrine on endogenous neural stem cell proliferation and differentiation

LUO Chun-shan, DENG Zhong-liangΔ, QIU Bing, LI Qing, WANG Yuan-zheng, LU Ting-sheng, YAO Shu-dan

（Department of Osteology, The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China）

ObjectiveTo discuss the effect of tetrandrine on endogenous neural stem cell proliferation and differentiation after spinal cord injury in rats.Methods78 rats were randomly divided into control group(n=36), Tet-treated group(n=36) and sham-operated group(n=6). Control group and Tet-treated group were adapted with Allen's combat modeling method. Rats in Tet group were injected Ted with a dosage 22.5 mg/kg in 30 minutes,24 hours and 48 hours after ASCI, and the same dose of saline was injected into injured group as control .Samples were dissected from the spinal cord injury sites at 1 day, 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks after ASCI, and tested by HE staining for morphology and by immunofluorescence staining for the expression of BrdU and nestin.ResultsA little Nestin positive cells and BrdU positive cells were found in control group and Tettreated group at 1 day after injury. A large number of positive cells were found in both groups at 1 week after injury and reached the peak which lasted for 2 weeks and then decreased gradually. The expression of Nestin positive cells and BrdU positive cells in control group and Tet-treated group were decreased significantly at 4 weeks after injury, but were still more than that in sham operation group. The number of Nestin positive cells and BrdU positive cells in Tet-treated group were more than that in control group at each time point after injury. The expression was higher in Tet-treated group than control group at 1 day, 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks after injury and had no difference at 4 weeks after injury.ConclusionTetrandrine could increase the number of Nestin positive cells, BrdU positive cells and endogenous neural stem cells though improving the microenvironment, and it is beneficial for the recovery of spinal cord injury in rats.

tetrandrine;spinal cord injury;endogenous neural stem cells

R 651．2

A

1005-1678(2014)02-0026-04

急性脊髓损伤在病理上表现为白质和灰质的损伤，现在普遍认为由原发性损伤和随着出现的继发性损伤造成。继发性损伤是序贯发生的复杂的自我毁灭的级联反应的过程，包括脊髓的低灌注及微循环障碍所致的缺血缺氧，脂质过氧化作用，兴奋性毒性氨基酸等毒性物质的积聚，炎症介质的瀑布式反应，细胞内钙超载，能量代谢异常等；其使大量的神经元变性坏死、轴突弥漫性脱髓鞘，从而导致损伤脊髓组织中大量的神经元缺失，使患者神经功能恢复不理想。近年来研究发现：在脊髓中央管周围的室管膜、膜下区存在内源性神经干细胞[1]（endogenous neural stem cells，ENSCs)，正常情况下处于休眠状态，脊髓受到损伤时，可刺激室管膜、膜下区ENSCs增殖分化[2-3]。但在损伤脊髓的微环境中存在抑制内源性神经干细胞增殖分化的负性因素，有利于ENSCs分化成星型胶质细胞和少突胶质细胞，而不利于分化成为促神经功能恢复的神经元和少突胶质细胞，造成脊髓损伤后功能恢复较差。随着脊髓损伤机制研究的深入，认为继发性损伤有可干预性，在早期减轻继发性损伤能保护残余脊髓组织、促进脊髓功能的修复。汉防己甲素是中药防己的有效成分，大量研究证明其具有抗炎、抗脂质过氧化、防止细胞受损、改善微循环及Ca2+拮抗作用。本实验主要探讨Tet对内源性神经干细胞增殖分化的影响来观察其对ASCI后神经功能的恢复。

贵州省科技英才项目资助[黔省专合字（2012）176号]

罗春山，男，博士，主任医师，研究方向：脊髓损伤的基础研究，E-mail：lyz 8088 gk@163.com；邓忠良，通信作者，男，博士，主任医师，研究方向：脊髓损伤的基础研究，E-mail：deng 7568@gmail.com。