不同佐剂的新城疫疫苗免疫效果的研究

施建春,杨惠萍

(1.上海市农业科学院 畜牧兽医研究所,上海 201106;2.国家家禽工程技术研究中心,上海 201106)

不同佐剂的新城疫疫苗免疫效果的研究

施建春1,2,杨惠萍1,2

(1.上海市农业科学院 畜牧兽医研究所,上海 201106;2.国家家禽工程技术研究中心,上海 201106)

为评价不同佐剂的新城疫(newcastle disease，ND)灭活疫苗对鸡的免疫效果，选用铝胶佐剂、国产油佐剂及进口油佐剂与新城疫病毒抗原混合制成疫苗，免疫雏鸡，探讨不同佐剂的疫苗对鸡的安全性、新城疫的HI抗体水平及攻毒保护率。结果表明，3种佐剂的疫苗注射部位无不良反应；28天时HI抗体分别为28.2、28.5和28.8；56天时HI抗体分别为27.4、28.8和29.2，攻毒后的保护率分别为90%、100%和100%，铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗以及对照组攻毒后肛棉拭子NDV阳性率分别为10%、0、0及100%。用进口油佐剂配制的疫苗可刺激接种动物产生快速免疫应答反应，抗体产生的效价高、维持的时间长，其效果优于其它佐剂，有望成为ND灭活疫苗的候选佐剂。

佐剂；新城疫病毒；ND的HI抗体；攻毒保护率

新城疫(newcastle disease，ND)是危害养鸡业的主要传染病之一,是由新城疫病毒引起的一种主要侵害鸡的急性高度接触传染性疾病。其主要临床症状是呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血[1]。新城疫发病率和死亡率都很高，疫苗免疫是防治ND暴发和避免造成重大损失的主要预防措施。鸡新城疫疫苗分为两大类，一类为灭活疫苗，另一类为减毒活疫苗。其中，灭活疫苗进一步分单纯灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗，目前应用较广泛的是油乳剂灭活疫苗。鸡新城疫灭活疫苗主要是由灭活剂灭活鸡新城疫病毒液后的半成品与佐剂以适当的比例混合配制而成。早在1925年，Ramon发现一些与抗原无关的物质如金属盐、皂角甘等可增强类毒素或白喉毒素的免疫效果，免疫佐剂便被广泛地应用于疫苗的生产和研究中[2]。佐剂可非特异性地通过物理或化学的方式与特异性抗原结合，从而诱导机体免疫系统(体液或细胞免疫系统)产生对抗原或免疫原的免疫应答反应，包括增强免疫反应强度和反应的持久性[3]。常用的佐剂有铝盐佐剂、矿物油佐剂、表面活性剂类佐剂、天然来源及中草药佐剂、细胞因子佐剂以及纳米佐剂等。为了筛选一种免疫效果好、副反应小的佐剂作为新城疫疫苗的佐剂，选择进口的油佐剂、国产的油佐剂及氢氧化铝佐剂配制鸡新城疫灭活疫苗，进行免疫效果的比较试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

新城疫病毒分离株及标准毒株由本实验室保存，血凝价大于10log2。

1.1.2 鸡胚及其它

SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物有限公司；铝胶佐剂由上海海利生物制品公司赠送，进口油佐剂为法国SEPPIC公司生产的产品，国产油佐剂为杭州杭州炼油厂生产的兽用白油。司班-80、吐温-80和硬脂酸铝均购自天津天大化工厂。

1.1.3 主要器材

96孔V型微量血凝板，TDL-5离心机，QL-861微量涡旋混匀机，BCD-216YH冰箱，DH5000AB温箱，20～200 μL及100～1000 μL移液器等。制备疫苗乳化设备：胶体磨。

1.1.4 实验动物

SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物有限公司，在本实验室孵化并在上海农业科学院畜牧兽医研究所动物房隔离饲养至30日龄。饲养期间不进行任何疫苗接种。

1.1.5 1%鸡红细胞悬液配制

配制浓度为0.85%的生理盐水，121℃高压灭菌30 min。SPF鸡翅下静脉采血，与等量阿氏液混合，离心，洗涤再离心，配制1%鸡红细胞悬液[4]。

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1.2 方法

1.2.1 病毒液制备

选取10 日龄健康鸡胚，将经无菌检验、外源病毒检验及毒价测定合格的新城疫种毒进行适当稀释后接种，每胚接种0.2 mL，放入后孵化室中。孵化温度37℃，湿度70%，培养72 h。期间照蛋每天2次，将24 h死亡的鸡胚取出废弃。收集24～72 h死亡鸡胚，2～8℃冷却，收集尿囊液，进行血凝试验，选取血凝价在7log2以上的尿囊液用于制备抗原。

1.2.2 病毒液的灭活及灭活检验

将制备的病毒液加0.20%的甲醛后摇匀置37℃、180 r·min-1摇床中灭活48 h。取小样接种6个10日龄健康鸡胚，0.2 mL·胚-1，放入37℃的孵化室中孵化。观察5日，之后收集尿囊液，进行血凝试验。

1.2.3 疫苗的制备

将前述灭活后的新城疫病毒分离毒与铝胶佐剂以1∶1的比例混合后充分摇匀，制成铝胶灭活苗。加入防腐剂硫柳汞，使最终浓度为0.01/%。

1.2.3.2 进口油佐剂灭活疫苗的制备

将前述灭活的ND病毒液与进口佐剂以1∶1的比例进行乳化即配制成新城疫油乳剂灭活苗。加入防腐剂硫柳汞，使最终浓度为0.01/%。

1.2.3.3 国产油佐剂灭活疫苗的制备

将前述灭活的病毒液与国产佐剂以6∶4的比例进行乳化即配制成新城疫油乳剂灭活苗。加入防腐剂硫柳汞，使最终浓度为0.01/%。

1.2.4 无菌检验

按照现行《中国兽药典》附录进行无菌检验[5]。

1.2.5 不同佐剂疫苗的安全性检验

用30日龄SPF鸡35只，随机分为4组，其中3组为免疫组，每组10只，分别肌肉注射铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂的新城疫灭活疫苗，每只1 mL(2羽份)；5只作为对照组不免疫，连续观察14日，观察注射部位及鸡全身的不良反应 。

1.2.6 不同佐剂疫苗的效力试验

1.2.6.1 血清学试验

用30日龄SPF鸡35只，共分4组其中3组为免疫组，每组10只，分别肌肉注射铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂的新城疫灭活疫苗每只0.2 mL(1/2.5羽份)；5只作为对照组不免疫。接种28日、56日后，每只鸡分别采血，分离血清，按照现行《中国兽药典》附录进行HI抗体效价测定[5]。

1.2.6.2 免疫攻毒试验

用30日龄SPF鸡40只，共分5组,其中3组为免疫组，每组10只，分别肌肉注射铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂的新城疫灭活疫苗每只0.2 mL，第4组5只作为攻毒对照组不免疫，随免疫组一起攻毒；第5组5只作为对照组不免疫，不攻毒，接种后56日，每只鸡分别肌肉注射新城疫病毒标准毒株，106.0LED50[6]；观察14 d，记录鸡的死亡数。

1.2.6.3 病毒分离

攻毒后第5天采集泄殖腔粪便，无菌处理后接种10日龄鸡胚并进行病毒分离。

2 结果

2.1 半成品的灭活检验

取小样接种6个10日龄健康鸡胚，观察5 d无死亡鸡胚，收胚后进行ND的HA检测，均无血凝性。

2.2 无菌检验

将3种疫苗分别接种TG小瓶(规格：50 mL)，1.0 mL·瓶-1，置 37℃培养，3 d后吸取培养物，分别接种TG小管、GA斜面管各2支和GP小管1支，0.2 mL·支-1，一支TG、GA置37℃，一支TG、GA、GP置 25℃，培养5 d，均无菌生长。

2.3 疫苗的安全性检验

用12日龄SPF鸡35只，每只肌肉注射疫苗1 mL，连续观察14 d。3个免疫组和对照组均注射部位无不良反应，所有鸡群食欲及精神状态良好，解剖免疫组鸡内脏均无病理变化，见表1。

表1 不同ND疫苗的安全性试验

2.4 疫苗的效力试验

2.4.1 血清学试验

肌肉注射铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗0.2 mL·只-1。接种后28日， HI抗体效价3组分别为28.2、28.5、28.8，接种后56日， HI抗体效价3组分别为27.4、28.8、29.2，见表2。统计学分析28日时,铝胶佐剂与国产油佐剂，铝胶佐剂与进口油佐剂，国产油佐剂与进口油佐剂之间的P值分别为0.104、0.025、0.193，所以国产油佐剂分别与进口油佐剂和铝胶佐剂组之间差异不显著，但进口油佐剂与铝胶佐剂组之间差异显著；56日时,铝胶佐剂与国产油佐剂，铝胶佐剂与进口油佐剂，国产油佐剂与进口油佐剂之间的P值分别为0.001、0.0002、0.343，铝胶佐剂分别与国产油佐剂和进口油佐剂组之间差异极显著，但进口油佐剂与进口油佐剂组之间差异不显著。

表2 3种ND灭活疫苗的HI抗体检测结果

2.4.2 免疫攻毒试验

肌肉注射铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗0.2 mL·只-1。接种后56日进行攻毒，3组的保护率分别为90%、100%、100%。具体结果见表3。

表3 不同疫苗的攻毒保护率试验

2.5 病毒分离

攻毒后第5天用棉拭子采集泄殖腔粪便，并进行病毒分离，对照组阳性率100%，铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗攻毒后病毒分离的阳性率分别为10%、0和0。

3 讨论与结论

免疫佐剂是生物反应调节剂中的免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件，如果这种作用过度或过强，必然会出现毒副作用[7]。因此，在佐剂选择时应选择不仅可引起适当的免疫促进作用且具有安全性的佐剂，与抗原在配比时用适当的比例配制来确保疫苗的应有粘度及稳定性等。

取灭活后的病毒液接种健康鸡胚，无死亡鸡胚，收胚后进行ND的HA检测，均无血凝性，说明ND病毒液灭活较彻底，配苗用的半成品是安全的。

矿物油佐剂应用最为普遍，在动物实验中大量使用，其免疫耐受性极好，且抗体滴度能够维持两个月，效果优于铝佐剂[8]。铝佐剂是目前兽用疫苗和人用疫苗中应用最广泛的佐剂，也是疫苗研究中常用的佐剂，所以在本次试验中选择铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂进行免疫接种。免疫接种3种疫苗后均无肿块及不良反应，说明3种佐剂的生物降解性强，佐剂释放和存储比较稳定，无毒副作用。

铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗免疫28 d后HI抗体水平分别为28.2、28.5、28.8，56 d后HI抗体水平分别为27.4、28.8、29.2，进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗抗体水平最高，铝胶佐剂配制的新城疫灭活疫苗抗体水平最低，56天时油佐剂配制的新城疫灭活疫苗抗体水平在升高而铝胶佐剂配制的新城疫灭活疫苗抗体水平开始降低；28日时进口油佐剂和铝胶佐剂组之间差异显著；56日时铝胶佐剂与国产油佐剂、进口油佐剂组差异显著。56天攻毒后铝胶佐剂、国产油佐剂、进口油佐剂配制的新城疫灭活疫苗的保护率分别为90%、100%、100%，病毒分离的阳性率分别为10%、0、0。综上所述，佐剂应选用进口的油佐剂。随着人们对抗原成分的了解和免疫机理的认识，对佐剂的研究也将具有目标性。未来的佐剂正朝着多元化的方向发展，新型佐剂的出现对疫苗研究和制备提供了更多的选择性[9]。

[1]蔡宝祥．家畜传染病学[M]．北京：中国农业出版社，1980：352．

[2]邝良德，任永军，郑洁,等．免疫佐剂研究概述[C]．四川省畜牧兽医学会2010年学术年会,2010:379-381．

[3]夏芳，罗满林，郭林,等．免疫佐剂的研究进展[J]．畜牧与饲料科学，2009，30(10)：150-152．

[4]中华人民共和国农业部．兽用生物制品质量标准[S]．北京：中国农业出版社，2005：321．

[5]国家药典委员会．中华人民共和国兽药典[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：21．

[6]中国兽医药品监察所农业部兽药评审中心．兽用生物制品质量标准汇编[M]．北京：中国农业出版社，2011：10．

[7]高泽乾，孙建男，武炜，等．兽用免疫佐剂的研究进展[J].唐山师范学院学报，2012，34(2)：45-51．

[8]Du C，Nilsson S，Lu H，et al．Immunogenicity of the Plasmodium falciparum Pf332-DBL Domain in combination with different adjuvants[J]．Vaccine，2010，28(31)：4977-4983．

[9]李宏胜，罗金印，王旭荣,等．不同佐剂的奶牛乳房炎多联苗对小鼠免疫机能的影响研究[J]．中国畜牧兽医，2013，40(1)：149-152．

ImmuneEffectsofDifferentAdjuvantsonNewcastleDiseaseVaccines

Shi Jianchun1,2, Yang Huiping1,2

(1.AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstitute，ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai201106,China;2.NationalPoultryEngineeringResearchCenter，Shanghai201106,China)

To evaluate the immune effects of vairous adjuvant in newcastle disease vaccine for chicks．In thispaper，vaccines were made combining Newcastle disease virus(NDV) with propolis adjuvant, adjuvant with domestic-made white oil, and adjuvant with imported -made white oil, respectively. Chicken were immunized to study the influence of different adjuvant on chicken safety, HI antibody of ND, and protection of ND vaccine against the virulent NDV. The results showed that no adverse reaction was observed in the three kinds of vaccines; at 28 days, HI antibody was 28.2, 28.5, 28.8, respectively, and at 56 days, HI antibody was 27.4, 28.8, 29.2, respectively. Protection of ND vaccine against the virulent NDV was 90%, 100%, 100%.In chickens inoculated with aluminum plastic adjuvants, domestic oil adjuvants, imported oil adjuvants in newcastle disease vaccine, and in the control group，the positive rates of NDV by the anal swab in were 10%, 0, 0, and 100%，respectively. The results showed that white oil adjuvant assistant inactive vaccine stimulated early immune response and produced a continuous and high level antibody．The vaccine candidacy of ND inactivated vaccine with white oil adjuvant was proposed．

Adjuvant；Newcastle disease virus；HI antibody of ND；Protection of ND vaccine against the virulent NDV

2014-07-08

2014-09-02

施建春(1968-)，男(汉)，上海人，助理研究员，研究方向：疫苗研发。

杨慧萍，副研究员。Tel:021-62205528;E-mail:yhp@saas.sh.cn

S855.3

A

1671-8151(2014)06-0522-04

(编辑：马荣博)