BQ123对大鼠肢体缺血-再灌注后肺损伤的影响*

刘燕，彭海兵，王建辉，王银环，张娜，李颖，朱丽艳，杨秀红，张连元

(1.河北联合大学基础医学院，唐山 063000;2.河北联合大学冀唐学院，唐山 063300)

肢体缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I-R)是临床常见的病理过程。肺是一个高灌注的器官，全身静脉血在肺毛细血管被动脉化，因此，在肢体I-R造成的全身炎症反应中肺组织容易受累[1]。内皮素(endothelin，ET)-1是一种有效的血管收缩剂，肺内血管和气管平滑肌尤其是肺动脉含有极多ET-1受体。ET-1存在ETA和ETB两种受体。BQ123是由5个氨基酸组成的环五肽，是特异性ETA受体阻断剂，可以直接阻断ETA受体活性，对ETB受体几乎无作用，具有高特异性、高亲和力和水溶性的特点，能有效抑制ET引起的升压效应。笔者探讨肢体I-R后肺损伤发生的可能机制以及BQ123对其影响，为临床防治肢体I-R后肺损伤提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性斯波雷格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠30 只，体质量 200 ～250 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号:SCXK(冀)2009-0017;使用许可证号:SYXK(冀)2010-0038。

1.2 仪器 美国产Scotsman AF30制冰机，Axiovert 200蔡司光学仪器购于上海，美国产Sigma-2M/ETM低温高速离心机。

1.3 试剂与试药 丙二醛(malondialdehyde，MDA)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、P-选择素试剂盒购于南京建成生物工程研究所;ET-1试剂盒购于解放军总医院科技开发中心放射免疫研究所;Fas、Bcl-2、Caspase-3及原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒购于北京中山生物试剂公司;BQ123购于美国Sigma公司。

1.4 模型制备与分组 将实验大鼠随机分为I-R组、BQ123组和对照组，每组10只。I-R组:采用止血带法制作I-R模型，用橡皮圈环绕结扎大鼠双后肢根部，并经激光多普勒血流仪监测并证实血流被阻断，4 h后松解橡皮带恢复血流灌注，再经过4 h后放血处死动物;BQ123组:操作同I-R组，松带前15 min经颈外静脉滴注BQ123溶液7 μg·kg－1;I-R组和对照组均于松带前15 min经颈外静脉滴注0.9%氯化钠溶液4 mL·kg－1。

1.5 指标观察 经腹主动脉放血致死动物后即刻取肺组织，液氮速冻，－70℃储藏备用。称取冻存的肺组织200 mg，移入装有冰冷0.9%氯化钠溶液2 mL的匀浆管中，冰浴条件下制备肺组织匀浆。用放射免疫法测定ET-1，采用生物化学法测定MPO、MDA，采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法测定P-选择素的含量。取肺组织经1%中性甲醛固定、包埋、切片，采用免疫组织化学方法检测Fas、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况。采用TUNEL法测定肺细胞凋亡。采用BI-2000医学图像分析系统对各组大鼠的肺组织切片进行分析，每个实验组分别随机选取6张切片，得出平均吸光度值(A)。每张切片计算6个高倍视野下的凋亡细胞数和阴性细胞数，并计算凋亡细胞百分率。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0版统计分析软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(±s)表示，多组间均值采用单因素方差分析及其两两比较SNK-q检验进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织 ET-1、MPO、MDA和 P-选择素值的变化I-R组与对照组比较，肺组织ET-1、MPO、MDA和P-选择素含量均显著升高(均P＜0.01);BQ123组与IR组比较，ET-1、MPO、MDA和 P-选择素均明显下降，但仍高于对照组(均P＜0.01)，见表1。

2.2 肺组织Fas、Bcl-2、Caspase-3和细胞凋亡率的变化 对照组肺支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺小血管壁Fas、Bcl-2、Caspase-3表达弱阳性;I-R组较对照组肺组织Fas、Bcl-2 Caspase-3表达明显上调;BQ123组肺组织Caspase-3、Fas的表达较I-R组明显减少，而Bcl-2表达明显增强。见表2。TUNEL染色显示，凋亡细胞核呈棕黄色或深褐色，以肺血管内皮细胞、支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞为主。对照组凋亡细胞数稀少，I-R组与对照组比较，凋亡细胞数明显增多。BQ123组与I-R组比较，凋亡细胞数减少。见图1。

表13 组大鼠ET-1、MPO、MDA和P-选择素的含量比较Tab.1 Comparison of the content of ET-1，MPO，MDA and P selection among three groups of rats ±s

表13 组大鼠ET-1、MPO、MDA和P-选择素的含量比较Tab.1 Comparison of the content of ET-1，MPO，MDA and P selection among three groups of rats ±s

与对照组比较，*1P ＜0.01;与 I-R组比较，*2P ＜0.01Compared with control group，*1P ＜0.01;compared with I-R group，*2P ＜0.01

组别 大鼠/只ET-1/(pg·mL－1)MPO/(U·g－1)MDA/(nmol·mg－1)P-选择素/(ng·mL－1)对照组 10 205.78 ±51.78 1.61 ±0.25 1.22 ±0.26 10.47 ±1.26 I-R 组 10 362.47 ±15.23*1 2.58 ±0.30*1 2.19 ±0.22*1 16.09 ±2.07*1 BQ123 组 10 301.08 ±35.21*1*2 2.18 ±0.13*1*2 1.74 ±0.30*1*2 12.51 ±1.65*1*2

表2 3组大鼠肺组织Fas、Bcl-2、Caspase-3吸光度和细胞凋亡率比较Tab.2 Comparison of the absorbance of Fas，Bcl-2，Caspase-3 and apoptosis among three groups of rats ±s

表2 3组大鼠肺组织Fas、Bcl-2、Caspase-3吸光度和细胞凋亡率比较Tab.2 Comparison of the absorbance of Fas，Bcl-2，Caspase-3 and apoptosis among three groups of rats ±s

与对照组比较，*1P ＜0.01;与 I-R组比较，*2P ＜0.01Compared with control group，*1P ＜0.01;compared with I-R group，*2P ＜0.01

/%对照组 10 0.095 ±0.002 0.100 ±0.001 0.095 ±0.003 4.17组别 大鼠/只 Fas Bcl-2 Caspase-3 细胞凋亡率±1.47 I-R 组 10 0.294 ±0.003*1 0.108 ±0.005*1 0.174 ±0.003*1 18.83 ±2.86*1 BQ123 组 10 0.115 ±0.007*1*2 0.128 ±0.005*1*2 0.159 ±0.006*1*2 10.67 ±2.16*1*2

3 讨论

各种组织来源的内皮细胞均可产生ET-1。ET-1可增强中性粒细胞、单核细胞的趋化，刺激白细胞释放炎性递质，促进氧自由基的产生[2-3]。P-选择素属于选择素家族一员，其表达于活化的血小板和组织内皮表面，是介导白细胞游出血管的主要黏附因子之一，在炎症中起重要的作用。肢体I-R后内皮细胞功能受损产生的ET-1、氧自由基等均可刺激肺内皮细胞表达P-选择素。本研究结果显示，再灌注后4 h，肺组织ET-1的含量升高，同时P-选择素含量明显增多，这为中性粒细胞在肺组织浸润、聚集提供了条件，在一定程度上使得中性粒细胞与肺血管壁接触增多。肺组织MPO含量增多，进一步说明组织中性粒细胞增多。MDA含量上升，提示肺组织氧化损伤加重。BQ123可以阻断ET-1与ETA受体结合，几乎无抑制ET-1结合ETB受体的作用。文献报道ETB受体可以清除循环中的ET[4]。本实验观察到BQ123组肺组织ET-1含量下降，可能与上述原因有关。BQ123组较 I-R组肺组织 P-选择素、MPO和MDA含量均明显减少，说明ETA受体阻断剂BQ123可抑制中性粒细胞在肺内的黏附、聚集，从而减少了后续炎症递质的大量释放，减轻肺组织氧化损伤。

研究表明，多种脏器在发生I-R损伤时会出现细胞凋亡，细胞凋亡导致的细胞丢失可导致肺功能受损[5]。本研究发现，I-R组TUNEL染色显示肺泡上皮细胞、肺血管内皮细胞及支气管上皮细胞出现凋亡现象，肺凋亡细胞百分率增大，提示细胞凋亡参与了肢体I-R后肺损伤。目前认为，死亡受体通路、线粒体通路是细胞凋亡发生的不同途径[6]。死亡受体途径可通过Fas/FasL诱导，Fas与FasL受体结合转导凋亡信号进入靶细胞并激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡。Bcl-2是线粒体凋亡通路成员，是重要的抗细胞凋亡基因[7]。两条通路最终都通过激活Caspase-3执行凋亡。结果显示，BQ123组较I-R组，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达明显升高，而促进凋亡的Fas、Caspase-3蛋白表达降低，这与细胞凋亡情况相一致，提示BQ123减轻了大鼠肢体I-R后肺细胞凋亡。

综上所述，ETA受体阻断剂BQ123可降低中性粒细胞在肺组织的聚集，抑制大鼠肢体I-R后肺细胞凋亡相关蛋白的表达，对肺组织产生保护作用。

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