甘肃党参水煎剂对D-半乳糖所致衰老小鼠脾脏细胞抗氧化作用及DNA损伤的影响

何 敏 舍雅莉 侯 茜 郭 美 王 岚 张 帆

(甘肃中医学院系统生物学与中医药转化研究所 中西医结合基础学科重点实验室，甘肃 兰州 730000)

中药党参是我国常用的传统补益药，其药理学功能有延缓衰老，抗氧化，调节肠道微生态平衡，影响免疫器官的重量，调控细胞因子，降低血脂，调节体液免疫，促进淋巴细胞增殖，影响单核巨噬细胞，促进造血功能等〔1，2〕。有研究表明甘肃党参水提物可能通过提高机体免疫功能,清除衰老机体产生过多的自由基，抗脂质过氧化而起到延缓衰老的作用〔3〕。本实验研究甘肃党参水煎剂对D-半乳糖致衰老小鼠脾脏细胞抗氧化和DNA损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 昆明种小鼠60只，雄性，体重(20±2)g，SPF级，由甘肃中医学院科研实验中心提供。

1.2药品与试剂与仪器 党参：素花党参(甘肃文县产，由甘肃中医学院药学系靳玲副教授鉴定)，制成含生药浓度为1 g/ml的水煎剂,置4℃备用。D-半乳糖：上海中秦有限公司(批号：20120104)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(货号：分别为A 001-1、A 005、A 002南京建成生物工程研究所提供)。PI染液、正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖，1%月桂酸肌氨酸钠、蛋白酶K、Tris、均购自美国Sigma公司；Na2EDTA购自瑞士Fluka &RDH 公司，其他试剂均为国产分析纯。Feb-80台式高速离心机：金坛市恒丰仪器厂；756 MC型分光光度计：上海第三分析仪器厂；水浴箱(ZHWY-110X30)，电泳槽和电泳仪：(BIO-RAD)；荧光显微镜(日本OLYMPUS-IX51)。

1.3方法 60只小鼠，随机分为正常组，模型组，党参低剂量、高剂量组，维生素E组，每组12只。正常组皮下注射0.9%生理盐水0.25 ml/10 g，其余各组每日颈背部皮下注射5%D-半乳糖0.25 ml/10 g，连续注射10 d。于第11天开始(每天继续注射D-半乳糖)党参低、高剂量组每日给予党参水煎剂5，15 g/kg灌胃，正常组和模型组予等体积生理盐水灌胃，维生素E组每日维生素E 50 mg/kg灌胃，再连续给药32 d。

1.4脾脏组织SOD、GSH-Px、MDA测定 于末次给药的次日，颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，称体重，脾脏组织加9倍体积的冰生理盐水，制成10%脾脏组织匀浆，然后(3 000～4 000)r/min离心10 min，取适量上清液采用黄嘌呤氧化酶法测定脾脏组织中总SOD活性，用5,5，-二硫对2-硝基苯甲酸(DTNB)法测定GSH-Px的活力，硫代巴比妥酸法检测脾脏组织中MDA活性，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.5脾细胞悬液的制备 颈椎脱臼法处死小鼠，迅速取脾脏组织放于含适量冰冷的PBS的平皿内，用眼科剪剪成糜状(约1 mm3组织块)，200目尼龙网过滤，收集细胞悬液，将细胞滤液1 600 r/min离心5 min，用PBS重新悬浮离心管低的细胞，并调整细胞密度。用4%的台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率接近90%，细胞密度为105～106个/ml。细胞吹打均匀后，向每个2.0 ml的离心管中各加400 μl脾细胞，在37℃水浴中孵育60 min。

1.6单细胞凝胶电泳 铺第一层胶：常规载玻片打磨，自来水清洗，泡酸过夜，自来水，双蒸水清洗烘干备用。取50 ℃以上，1%的正常熔点的胶50 μl/片给备好的磨片铺第一层胶备用。铺第二层胶：取孵育好的细胞和40℃、1.2 ml 1%的低熔点的胶各400 μl吹打均匀放在37℃水浴箱水浴，将上述两种液体各取1.4 ml，制成混悬液均匀的铺在备好的胶片上，室温下静止3～4 min。裂解：将凝胶浸入4℃预冷的裂解液中，放在4℃冰箱1 h后移入37℃、CO2培养箱过夜。电泳：从裂解液中移出载玻片，用pH 8.5的TBE漂洗3次，每次30 min，在第3次漂洗时将4℃预冷的TBE加入电泳槽，静止20～30 min后，将漂洗好的玻片移入电泳槽里，随后在相同电泳液中以电压25 V，电流300 mA，室温避光条件下电泳30 min。固定：电泳完成后取出玻片移入暗盒，加1%的H2O2固定10 min后，用蒸馏水漂洗3次，每次3 min。染色：用5 μg/ml PI染液染色30 min，双蒸水洗掉表面的染料，24 h内在倒置荧光显微镜20倍物镜下进行观察，照相，激光波长488 nm。

1.7统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1甘肃党参水煎剂对脾脏细胞的抗氧化作用 模型组小鼠SOD、GSH-Px活性显著低于正常组(P<0.01)。甘肃党参水煎剂高剂量组、维生素E组与模型组相比SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.01，P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.01)。党参低剂量组无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2甘肃党参水煎剂对脾脏细胞DNA损伤的影响 模型组小鼠脾细胞的尾距和尾部DNA含量显著高于正常组(P<0.01)。甘肃党参水煎剂高剂量组、低剂量组、维生素E组与模型组相比小鼠脾细胞的尾距和尾部DNA含量显著降低(P<0.01)，见表1。

表1 甘肃党参水煎剂对D-半乳糖致衰老小鼠脾脏组织SOD、GSH-Px活性、MDA含量及脾脏细胞DNA损伤的影响(n=12,±s)

3 讨 论

机体衰老的分子机制包括诸多因素,而自由基的损伤在衰老机制的研究中占有一定的地位。机体自由基学说认为引起人体衰老的主要原因是人体细胞代谢过程中不断产生自由基，自由基在体内积累过多，过剩的自由基就会使类脂质中的不饱和脂肪酸发生过氧化，从而破坏细胞的膜结构，使膜功能失常，导致细胞死亡。同时脂质过氧化过程的延伸阶段产生脂过氧自由基LOO·、脂氧自由基LO·、和脂自由基L·、终止阶段产生的小分子丙二醛等，均可对DNA造成损伤〔4〕，有资料表明：DNA随年龄的增长，损伤增加，修复能力减弱〔5〕，引发DNA损伤的因素很多，DNA分子在环境中的X线、紫外线、化学药品等及体内自由基等因素作用下均可受到损伤。而体内氧化-还原反应的代谢产物氧自由基(OH)就是其中主要因素之一。因此，寻找能清除氧自由基，并能保护DNA损伤的有效物质，以保护DNA双链完整性，防止基因突变，亦是现在延缓衰老以及防治某些疾病特别是防治肿瘤中一个新的研究方向。

单细胞凝胶电泳实验(SCGE) 或称彗星试验〔6，7〕，是一种直接在荧光显微镜下用肉眼观察单个细胞DNA链断裂的试验方法。在碱处理和碱性电泳的作用下DNA解螺旋,使DNA的断链和碱易变性DNA片段从严密的超螺旋结构中释放出来；由于这些DNA断链分子量小且碱变性为单链，所以在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动，产生一个尾状带，未损伤的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。在一定范围内，“彗星”的长度(代表DNA迁移距离)和经荧光染色后“彗星”荧光强度(代表DNA的量)与DNA损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的DNA损伤〔8，9〕，进而反映整个细胞、组织、器官内DNA整体损伤程度的大小。

D-半乳糖连续诱导的亚急性衰老小鼠模型较为公认，可以用于行为学、抗氧化以及免疫学等方面的抗衰老药物药效的研究〔10～12〕。本实验研究说明甘肃素花党参水煎剂能使衰老小鼠脾脏细胞SOD，GSH-Px活力增强，MDA含量降低，并且有效减少DNA的损伤。因此，甘肃素花党参水煎剂能增强D-半乳糖致衰老小鼠脾脏细胞抗氧化能力及保护DNA的作用。

4 参考文献

1陈克克.中药党参的研究概况〔J〕.西安文理学院学报·自然科学版，2008；11(2)：33-9.

2朱南山，李丽立，张 彬，等.党参的生物学功能及其应用前景〔J〕.饲料工程，2006；10(20)：23-4.

3王 岚，张 帆，王 艳，等.甘肃党参水提物对D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织SOD、MDA影响的实验研究〔J〕.中国中医药科技，2010；17(2)：148-9.

4Mo J.Free radical biology for medicine〔M〕.Beijing:The Press of Peoples Public Health,1989:7025.

5李顺成，蒋文跃，王传社，等.扶正化疥复方康寿饮延缓衰老的研究回顾〔J〕.中国中西医结合杂志，1996；16(4)：244-6.

6孟紫强，张连珍.应用慧星实验研究细胞DNA损伤的原理和方法〔J〕.中国公共卫生，1998；14(7)：425-7.

7Singh NP.Technical report:modification of alkaline micro-gel electrophoresis for sensitive detection of DNA damage〔J〕.Int Radiat Biol,1994;66(1):23-8.

8Ross GM,McMillan TJ,Wilcox P,etal.The single cell microgel electrophoresis assay(comet assay):technical aspects and applications〔J〕.Mutat Res,1995;337(1):57-60.

9Klaude M,Eriksson S,Nygren J,etal.The comet assay:mechanisms and technical considerations 〔J〕.Mutat Res,1996;363(2):89-96.

10秦红兵，杨 朝，范忆江，等.D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的建立与评价〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2009；13(7)：1275-8.

11刘 洋，程清洲，彭超华，等.D-半乳糖致小鼠衰老模型的制作及效果评价〔J〕.武汉工业学院报，2009；28(1)：32-4.

12朱亚珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法〔J〕.复旦学报:医学版，2007；34(4)：617-9.