复元胶囊对大鼠膝骨关节炎模型软骨细胞凋亡及增殖的影响

周小莉 苟晓燕 李荣亨

(重庆市中医院风湿病科，重庆 400021)

研究发现一氧化氮(NO)参与介导的软骨细胞凋亡在关节软骨退行性改变过程中起着重要作用〔1，2〕。复元胶囊是临床上长期用于治疗骨关节炎(OA)疗效有明显的中药复方实验制剂，本实验观察复元胶囊对OA模型大鼠软骨细胞凋亡、关节液中NO及软骨细胞核增殖抗原(PCNA)mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验药物 复元胶囊由人参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子等组成，委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊，仅供实验使用(医院制剂批号：[2005]12号B-55)；壮骨关节丸，由深圳三九医药业股份有限公司生产，批号：Z44023377。

1.2实验动物 雄性成年SD大鼠48只200～250 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(渝)2002007。

1.3实验试剂 TUNEL试剂盒购自美国Roche公司；硝酸还原酶法NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；蛋白酶K购自美国Sigma公司；DAB显色试剂盒购自北京金桥中衫生物技术有限责任公司；RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；两步法RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司；PCNA及内参GAPDH引物购自上海Sangon公司引物序列为：DL2000型DNA Maker购自TaKaRa公司；DEPC水购自sigma公司；琼脂糖粉购自北京金桥中衫生物技术有限责任公司；GoldViewTM核酸染料购自北京赛百盛公司。

1.4实验仪器 RD2000型X线机：美国长青公司；BX-50行生物显微镜：日本Olympus公司；HITACHI-7500型透射电镜：日本HITACHI公司；BX40型光学显微镜：日本OLYMPUS公司；ELX-800型酶标仪： 德国Eppendorf公司；PCR 仪：德国EPPENDORF公司；Bio-RAD电泳仪及凝胶成像仪：美国BioRad公司。PCNA(290 bp)正向：5' TTGGAATCCCAGAACAGG3'；反向5'AGACAGTGGAGTGGCTTT3'；GAPDH(492 bp)正向：5'ATCACTGCCACCCAGAAGACT3'；反向5'CATGCCAGAGGTCGGTTCGTTTT3'。

1.5方法

1.5.1动物分组 48只SD大鼠随机分成四组，分别为正常组、模型组、壮骨关节丸组以及复元胶囊组，每组12只。

1.5.2建立动物模型 除正常组外，其余各组参照Hulth造模型方法〔3〕。0.5%的水合氯醛按0.35 g/100 g腹腔注射麻醉大鼠，在无菌条件下切断右膝内侧副韧带、切除内侧半月板以及剪断前交叉韧带，逐层缝合，无菌包扎。术后每天肌注青霉素2×104U/kg，共3 d。1 w后，每天驱赶大鼠跑步30 min。

1.5.3给药 根据Meeh-Rubner公式〔4〕计算大鼠的给药剂量。手术后第4周，复元胶囊组给予复元胶囊0.72 g·kg-1·d-1(相当生药5.76 g·kg-1·d-1)、壮骨关节丸组给予壮骨关节丸1.14 g·kg-1·d-1配制成3 ml溶液，正常组、模型组分别给予生理盐水3 ml，每天灌胃1次，共8 w。

1.6观察指标

1.6.1大体肉眼观察 大鼠抽取血液及关节炎液后处死，肉眼观察膝关节有无滑膜肿胀，并于解剖显微镜下观察股骨内髁、内侧胫骨平台关节面的病理改变。

1.6.2光镜观察软骨细胞及基质 取股骨内髁全层软骨标本置于4%中性缓冲甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色。观察软骨组织的结构、细胞数量和潮线的完整性，根据Mankin法进行评分。

1.6.3电镜观察软骨细胞及基质 锐利刀片切取1 cm3大小股骨内髁损伤部位全层软骨，立即放人4 ℃的2.5%戊二醛中固定2 h。10%EDTA脱钙3 w，1%锇酸固定2 h，4 ℃冰箱内用乙醇逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片50～60 μm，电子染色，并在HITACHI-7500型透射电镜下观察。

1.6.4TUNEL法检测软骨细胞凋亡 参照Roche公司TUNEL试剂说明书操作，并设立阴性对照。阳性判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片任取5个视野，高倍镜下计数阳性细胞和总细胞数，细胞凋亡指数(AI) =TUNEL标记阳性细胞数/软骨细胞数×100%。

1.6.5硝酸还原酶法检测关节液中NO活性 按照NO测定试剂盒说明书要求设置标准管和空白管，空白管调零，紫外分光光度计在530 nm波长下测定吸光度值(A)。

1.6.6RT-PCR法检测PCNA mRNA表达 用Trizol提取各组软骨的总RNA。各组取1 μl总RNA，逆转录合成cDNA，逆转录反应体系总体积10 μl(含MgC 12 2 μl、10×RT缓冲液1 μl、 RNase Free dH2O 3.75 μl、dNTP混合物1 μl、RNase抑制剂0.25 μl、转录酶0.5 μl、Oligo酶0.5 μl)。取逆转录产物3 μl进行PCR循环(94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环，末次延伸10 min,4 ℃保存)。反应完毕，取反应产物10 μl于1.5%含50 μl/L GoldViewTM核酸染料琼脂糖凝胶中进行电泳，BIO-RAD凝胶成像仪中紫外光下观察拍照，用Quantity One凝胶图像分析软件检测各组目的基因及其GAPDH基因的光密度值，计算二者的比值，作为各组mRNA的相对表达量。

1.7统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1大体形态观察 正常组大鼠关节软骨外观呈蓝白色，表面光滑，色泽明亮润泽，无裂纹及软化，滑膜未充血增生，关节液清亮。模型组软骨表面极不光滑，色泽晦暗，局部软骨有缺损，甚至有溃疡出现，深者可达骨质，软骨下骨暴露，软骨边缘有较多骨赘形成，滑膜充血增生，关节液浑浊。复元胶囊组和壮骨关节丸组滑膜有明显增生，胫骨平台变浅，软骨表面不太规则，部分软骨有裂纹，甚至有细小溃疡出现，壮骨关节丸组出现上述改变的程度大于复元胶囊组。

2.2各组大鼠膝关节软骨组织形态观察 软骨表面连续性好，层次清晰，潮线完整，细胞排列整齐，分布均匀。模型组软骨表层有明显凹陷，结构难以分辨，严重的表层消失，部分区域呈绒毛状，可见较多裂隙从表层软骨延伸向下深达辐射层，裂隙中可见稀疏结缔组织及松散的网状连接，有纤维充填，潮线消失。壮骨关节丸组软骨裂隙深达软骨下骨，细胞排列紊乱，表层细胞数量减少，中深层可见细胞簇集成团，潮线消失。复元胶囊组软骨4层界限欠清楚，在表层的凹陷中有软骨细胞充填，周围细胞有簇集现象，潮线多数不完整。模型组软骨Mankin评分明显高于正常组，复元胶囊组软骨Mankin评分明显低于模型组(P<0.01),复元胶囊组软骨Mankin评分比壮骨关节丸组低(P< 0.05)。见表1。

2.3透射电镜下观察软骨细胞超微结构 正常组软骨细胞核完整，核膜清晰，核内染色体均匀分布，粗面内质网呈层状排列，线粒体散在分布、细胞表面有许多微绒毛突起。凋亡细胞体积明显缩小，突起消失。细胞从周围软骨基质退缩，核膜发生皱褶，染色体浓集，胞质密度增高,有典型的凋亡小体，内有细胞器,细胞周围可见脱落的凋亡小体。

2.4TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况 凋亡的软骨细胞核呈棕黄色，主要分布在软骨的浅层和中层。正常软骨中有弱阳性表达，主要位于软骨表层；模型组软骨的移行层和深层有阳性细胞表达，AI明显高于正常组。壮骨关节丸组和复元胶囊组在表层和移行层也有阳性细胞表达，但AI明显低于模型组(P< 0.05)，而复元胶囊组和壮骨关节丸组比较差异显著(P< 0.05)，见表1。

表1 复元胶囊对膝OA软骨Mankin评分及AI的影响±s，n=12)

2.5复元胶囊对大鼠膝骨关节炎关节液中NO的影响 模型组、壮骨关节丸组和复元胶囊组关节液中NO浓度较正常组升高(P<0.01)，而壮骨关节丸组和复元胶囊组比模型组明显降低(P<0.01)，复元胶囊组关节液中NO水平低于壮骨关节丸组(P<0.05)。见表2。

2.6复元胶囊对关节软骨PCNA mRNA表达的影响 各组软骨提取的RNA经逆转录并PCNA序列扩增后，电泳显示不同的荧光强度。造模后各组软骨节软骨PCNA mRNA表达代偿性增加，复元胶囊组与壮关节丸组PCNA mRNA增加高于模型组(P<0.05)；复元胶囊组与壮骨关节丸组PCNA mRNA表达比较差异显著(P<0.05)。见表2。

表2 复元胶囊对膝OA关节液中NO、软骨细胞PCNA mRNA的影响±s，n=12)

3 讨 论

研究发现，复元胶囊能促进离体软骨细胞DNA及Ⅱ型胶原的合成〔5〕，同时，降低大鼠OA模型血清中软骨代谢标志物COMP水平，从而延缓骨关节炎软骨退变过程〔6〕。本研究从NO介导的凋亡及增殖角度研究复元胶囊治疗OA的作用机制。

关节软骨退行性改变是OA发病的中心环节，共同的病理学特征是关节软骨进行性变性、破坏，软骨下骨硬化，关节边缘和软骨下骨反应性增生，骨赘形成〔7〕。通过比较复元胶囊组与模型组软骨外观大体观察、组织学评分，我们可以看出复元胶囊对膝OA模型的软骨退变有明显的保护作用，延缓OA病程。

软骨细胞过度凋亡在软骨退行性改变过程中起着重要作用。本实验结果显示，透射电镜下可观察到典型的凋亡形态,包括细胞体积缩小、染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等；细胞凋亡末端原位检测(TUNEL)发现，经Hulth法建立的OA动物模型关节软骨有凋亡细胞阳性表达，主要位于浅层和中层，移行层和深层也有阳性细胞表达明显，高于正常组，再次证明软骨细胞凋亡参与了OA的病理改变。

软骨细胞凋亡的诱导有两个独立通路，一是NO依赖通路，二是Fas介导的非NO依赖通路，在OA中NO依赖通路更重要〔2〕，所以通过抑制NO的活性从而抑制细胞过度凋亡可能是一条治疗OA的途径。本实验结果提示，造模后关节液中NO浓度显著升高，复元胶囊能降低OA模型膝关节液中的NO浓度。而NO又是诱导凋亡的主要途径之一，降低NO活性，抑制软骨细胞凋亡，从而保护了软骨。因此复元胶囊能通过抑制NO途径，从而抑制软骨细胞的凋亡。

软骨细胞因过度凋亡，导致软骨破坏，但同时也启动了机体的增殖，软骨细胞通过增殖来代偿，维持平衡状态〔8〕。PCNA是从G1期后半至S期前半过程中细胞核内急剧增多的一种核蛋白质，目前认为它的表达是衡量细胞增殖的重要标记物〔9〕。OA患者损伤关节软骨及负重区软骨中的软骨细胞数少于正常人关节软骨细胞数，凋亡引起软骨细胞数量减少伴有细胞代偿性的增殖〔10〕。本研究发现，造OA模型后软骨细胞凋亡伴有软骨PCNA mRNA表达代偿性增加，体现了OA的发病是损伤与抗损伤相互作用的结果。复元胶囊能促进软骨PCNA mRNA的表达，提示复元胶囊可通过促进软骨细胞增殖而对OA软骨起保护作用。

综上，复元胶囊可以减轻骨关节炎关节软骨的病理改变，降低软骨细胞凋亡指数及关节液中NO水平，增加软骨PCNA mRNA的表达，从而减缓骨关节炎病变的发展。

4 参考文献

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