甲珠对肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响

付德才 吴杭源

(无锡市第五人民医院，江苏 无锡 214007)

肝纤维化是肝硬化的前期阶段，肝星型细胞(HSC)活化是肝纤维化发生、发展的中心环节〔1,2〕。诱发HSC活化的因素很多，其中病毒、酒精、药物、自身免疫是已知的主要因素。肝组织活检是诊断肝纤维化的金标准，肝组织病理学改善，证实抗纤维化治疗有效，肝组织病理学改善是判断抗纤维化治疗疗效的直接证据。本实验观察甲珠抗肝纤维化治疗后肝组织病理改变，判断甲珠抗肝纤维化治疗疗效。

1 材料和方法

1.1材料 雄性Wistar大鼠108只，鼠龄23个月，体质量(180±30)g,甲珠研细末用前采用蒸馏水制成混悬液。高剂量组为2.0 g/kg(体质量)，中剂量组为1.0 g/kg(体质量)，低剂量组为0.5 g/kg(体质量)。结合大鼠胃的承受量按2 ml/次，2次/d灌胃。

1.2方法

1.2.1模型制作 实验第1天除正常空白对照组(简称对照组)外，其余动物予CCl4分析纯5 ml/kg体质量，以后每隔3 d注射400 ml/L CCl4橄榄油剂3 ml/kg体质量，连续8 w。实验前2 w饲喂高脂玉米粉饲料(795 g/kg玉米粉+200 g/kg猪油+5 g/kg胆固醇)，第3～6周饲喂1 000 g/kg玉米粉和300 ml/L乙醇饮料。

1.2.2分组及给药方法 采用成组设计，将108只大鼠随机分为6组，每组18只，对照组，饲喂正常饮食；模型组，按上述造模方法给予饮食；秋水仙碱组，于造模第3周开始给予秋水仙碱0.1 mg·kg-1·d-1；甲珠高剂量治疗组，于造模第3周开始予甲珠混悬液2.0 g·kg-1·d-1(体质量);甲珠中剂量治疗组，于造模第3周开始予甲珠混悬液1.0 g·kg-1·d-1(体质量)；甲珠低剂量治疗组，于造模第3周开始，给予甲珠混悬液0.5 g·kg-1·d-1(体质量)，共8 w。造模结束时模型组死亡3只，中剂量组死亡3只，低剂量组死亡2只，秋水仙碱组死亡2只，高剂量组死亡1只，为增加可比性，每组均采用15只。

1.2.3标本制作 上述造模及处理过程结束后，禁食12 h后称质量，心包取血，分离血清置-20℃保存；并立刻完整摘取肝脏及脾脏，肝右叶置于40 g/L中性甲醛液中常规固定后，石蜡包埋，用于制作组织芯片。

1.2.4检测指标 采用Masson三色染色法。染色结果：胶原纤维呈蓝色，细胞核呈蓝黑色，胞质呈深红色；染色结果判定：Masson染色后在光镜下观察组织切片的病理变化并摄片。每张切片取四周及中央区域，选取胶原纤维含量最多的视野，每个视野含一个汇管区。采用HIAPS-2000型计算机图像分析系统，通过显微摄影系统摄取图像并输入图像分析系统进行灰度变换，使胶原纤维着色区域与背景分开，自动记录着色面积和总面积。于200倍镜下测定胶原纤维面积百分比，计算方法为：胶原纤维面积/肝组织面积×100%，取平均值。

2 结 果

正常组大鼠肝小叶结构正常，肝索排列规则，小叶周边仅见少量胶原纤维呈蓝色，染色较轻。模型组大鼠肝组织胶原纤维明显增生，沿汇管区或炎症坏死区向外延伸，形成厚薄不一的纤维间隔，分割包绕肝小叶，局部有假小叶形成。甲珠干预各组肝组织也有少量的胶原纤维增生，主要分布于肝脏间质内，部分向肝小叶内伸展，且胶原纤维较纤细，部分区域可见胶原纤维沿炎症坏死区延伸，形成间断、薄的纤维间隔，无明显假小叶形成。秋水仙碱组介于治疗组和模型组之间。见图1。

图1 小鼠肝组织Masson染色结果(×200)

Masson胶原染色定量分析结果表明，模型组胶原显色指数(12.70±1.03)明显高于正常对照组(0.35±0.036)(P<0.01)，甲珠高剂量组(6.34±0.66)、中剂量组(8.51±0.96)和秋水仙碱组(8.45±0.82)胶原显色指数显著低于模型组(P<0.01)，甲珠低剂量组胶原显色指数(11.88±1.44)明显低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

肝纤维化是指各种致病因素引起肝脏损害和炎症，在修复过程中导致肝脏细胞外基质异常增多和过度沉积的病理过程。病情进展可发展为肝硬化，甚至发生癌变。研究证实肝纤维化与临床抗病毒疗效呈负相关，与肝癌发生正相关。肝纤维化可能是由于长期的肝损伤启动肝内细胞凋亡而引起的：肝细胞凋亡后形成的凋亡小体和其他细胞碎片被HSC吞噬，引起HSC的活化、增殖、转化成肌成纤维样细胞，最终导致细胞外基质的沉积形成纤维化〔3〕。Bcl-2家族通过激活一系列下游基因发挥调节细胞凋亡的作用〔4〕，Bcl-2、Bax的表达变化决定了肝细胞、HSC的凋亡，进而影响纤维化的进程〔5〕。正常细胞中Bax主要定位于细胞质内，受到损伤、刺激后，激活的Bax将重新定位于线粒体表面，直接或间接的在线粒体上形成孔道，引起细胞色素C的释放，从而诱导细胞凋亡〔6〕。肝细胞凋亡是调节肝组织正常细胞更新、增殖以及再生的重要机制，有抗感染、肿瘤及防止 自身免疫反应等作用，而肝细胞过度凋亡则会导致肝衰竭.同时肝细胞凋亡也是造成肝脏损伤和肝脏疾病的中心环节〔7〕。

研究发现慢性炎症反应过程可导致氧化应激的增加和降低胞内抗氧化能力〔8〕,目前认为肝细胞受损产生的脂质过氧化作用为HSC的激活和纤维化的产生提供了基础〔9〕，脂质过氧化是肝纤维化发生途径中的重要环节之一。HSC内的活性氧(ROS)通过氧化敏感的蛋白激酶和转录因子调控各种介质的活化和表达，诱导肝纤维化〔10,11〕。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶NOX是细胞内ROS产生的主要酶来源，在肝纤维化中起重要作用，也许因此成为治疗肝纤维化的重要新型靶点〔12〕。

祖国医学辩证认为肝纤维化是由于气滞、血瘀、络阻所致，肝纤维化初期主要为气滞，进而血瘀，最后络阻，气机不畅，肝纤维化、肝硬化形成。抗纤维化治疗，可以减少肝硬化并发症门脉高压、腹水、消化道出血等的发生，中医药具有潜在的优势〔13〕。甲珠为穿山甲的鳞片，主归肝经，具有软坚、通络、散结的功效，是历代医家治疗癥、瘕、集、聚的常用药，近来，被广泛用治肝硬化取得了较好的临床效果。 本实验证实甲珠对实验大鼠从HSC活化、细胞外基质形成、细胞因子释放、肝细胞氧化应激的发生等多方面干预肝纤维化的发生和抑制肝纤维化的进展。

4 参考文献

1Sakata R，Ueno T，Nakamura T，etal.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallat inhibits platelet-derived growth factor-induced proliferation of human he patic stellate cell line LI90〔J〕.J Hepatol，2004;40(1):52-9.

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9邵祥强，肖华胜.肝纤维化发病机制与临床诊断的研究进展 〔J〕.世界华人消化杂志，2011；19 (3)：268-74.

10Cui W，Matsuno K,Iwata K,etal.NOX1/nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，reduced form (NADPH) oxidase promotes proliferation of stellate cells and aggravates liver fibrosis induced by bile duct ligation〔J〕.Hepatology，2011；54(3)：949-58.

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13李 川，吕文良.常见中药复方制剂抗肝纤维化机制研究进展〔J〕.环球中医药，2013；6(1):70-3.