齐墩果酸对快速老化小鼠海马神经元及APP/PS1基因表达的影响

张琳琳 张素玲 张玉莲 王 凯 王雪研

(天津中医药大学第二附属医院脑病科，天津 300150)

阿尔茨海默病(AD) 是一种进行性的以认知功能障碍、记忆能力下降为特点的神经变性病，主要临床特征是患者出现智力、记忆力、感觉定向不可逆退化，其特征性的病理改变主要有老年斑(SP)、神经元纤维缠结(NFT)、神经元大量丢失〔1〕。从中医角度来讲，AD是由于“肾精亏虚”、“髓海不足”引起的〔2〕，因此用补肾中药防治AD有重要的作用。故本研究拟观察补肾中药女贞子的有效成分齐墩果酸对快速老化小鼠(SAMP8)海马神经元及APP、PS1基因表达的影响。

1 材料和方法

1.1动物及分组 选择9月龄(从出生前后±3 d)健康雄性SMAP8 30只，体质量 (30±2)g，购自中国生物工程研究所。按照随机数字表法随机分为模型组、齐墩果酸组、盐酸多奈哌齐(安理申)组，每组10只。另取10只SAMR1作为正常组。

1.2药物配制和干预 齐墩果酸(纯度>99%，批号：110325，购自上海友思生物技术有限公司)用研钵研磨，混悬于蒸馏水中，制成5 g/L齐墩果酸悬液。齐墩果酸组给予齐墩果酸(50 mg/kg)灌胃治疗，1次/d，连续灌胃4 w。安理申(批号：110507A)，购自卫材药业有限公司。安理申用研钵研磨，混悬于蒸馏水中，制成0.13 mg/ml的溶液。安理申组给予等量安理申溶液(1.3 mg/kg)灌胃。模型组与正常组均给予等量生理盐水灌胃。

1.3仪器和试剂 全自动多功能显微镜(leica dm rxa2)由德国莱卡公司提供。实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)试剂如 Oligo dT、dNTP、RNA 抑制酶购自宝生物工程(大连)有限公司；逆转录酶、GoTaqGreen Master mix 购自美国Promega公司；Quanti Tect TM SYBR Green PCR Kit购自美国QIAGEN公司；PS1和β-actin Taqman 引物由上海生物工程有限公司合成。实时定量PCR仪(RG-3000)，Rotor-Gene生产；PCR仪〔TC-96/g/h(b)〕杭州博日科技有限公司生产。

1.4海马区神经元光镜检测 各组小鼠快速断头取脑固定，修块后浸入PBS，脱水包埋后切片，厚度10 μm，烘干8 h以上进行HE染色，将切片置于光镜下观察海马区神经元。

1.5聚合酶链反应(PCR)检测 采用异硫氰酸胍、酚和氯仿抽提法提取组织总RNA。在逆转录反应体系中按照试剂盒说明进行逆转录反应，PCR 扩增参照试剂盒说明，引物序列见表1。反应条件：95 ℃预变性15 min，94℃变性20 s，59 ℃退火加延伸20 s，40个循环。

表1 引物序列

2 结 果

图1 各组小鼠海马DG区神经元形态学观察(HE，×40)

2.1光镜下观察海马神经元形态学变化 图1可见，R1组可见神经元轮廓清楚，突出明显，核浆比值大，细胞核为圆形或椭圆形，着色均匀为浅蓝紫色，可见深染的核仁。模型组：全部神经细胞胞体缩小，胞质浓缩，核固缩，整个细胞深染成红色，看不到形态正常的神经元。安理申组：一部分神经细胞胞体缩小，胞质浓缩，核固缩，可见部分形态正常的神经元；齐墩果酸组：小部分神经细胞胞体缩小，胞质浓缩，核固缩，大部分神经元细胞胞体正常，胞质完好。

2.2RT-PCR法检测APP基因的表达 模型组(1.00±0.00)与正常组(0.37±0.01)相比，APP基因的升高有统计学意义(P<0.05)。齐墩果酸组(0.41±0.06)与模型组相比，APP基因表达量有统计学意义(P<0.05)。安理申组(0.94±0.10)与模型组相比，APP基因表达量的降低无统计学意义(P>0.05)。

2.3PT-PCR法检测PS1基因的表达 模型组(1.00±0.00)与正常组(0.50±0.02)相比，PS1基因的升高有统计学意义(P<0.05)。齐墩果酸组(0.55±0.05)与模型组相比，PS1基因表达量的降低有统计学意义(P<0.05)。安理申组(0.92±0.08)与模型组相比，PS1基因表达量的降低无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

肾中精气的盛衰严重影响到脑的认知功能。肾精充足，髓海有余，脑主智能活动的功能才能充分发挥。反之，肾精亏虚，髓海失养，则见记忆力减退，智能障碍〔3〕。因此AD病变虽然在脑，但是病源在肾精不足。而采用“补肾生精”的方法治疗“痴呆”、“善忘”这类疾病，在延缓和控制疾病的发展上确有疗效〔4〕。

女贞子味甘苦、性凉，归肝肾经，具有滋补肝肾、益阴养血之功，是滋补肝肾之良药，主要用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等症。齐墩果酸是女贞子的主要有效成分，属于不饱和三萜化合物。具有护肝、解毒，降糖、降脂，调节免疫和抗氧化的作用〔5〕，对谷氨酸诱导的海马神经元损伤有一定的保护作用〔6〕。本研究结果也证实了齐墩果酸组有激活神经元细胞的趋势，并且优于西药安理申组，说明了Aβ级联假说认为，Aβ是AD发病的核心环节，其异常分泌和产生过多导致在特定脑区内聚集，引发相应的神经毒性作用，造成突触损伤，神经元死亡〔7〕。目前普遍认为聚集状的Aβ即Aβ1～42具有更强的毒性，且更容易聚集，从而形成Aβ沉淀的核心，引发神经毒性作用〔8〕。PS1基因突变可以导致Aβ1～42/Aβ1～40比例增加，使Aβ毒性增强〔9〕。反之，PS1基因的减少可以一定程度上使Aβ1～42减少，进而降低 Aβ的毒性。本研究发现齐墩果酸对SAMP8海马DG区神经元有保护作用；而且齐墩果酸可下调SAMP8海马组织内APP及PS1基因的表达。因此推测补肾中药女贞子可能通过下调海马组织APP及PS1基因的表达，抑制Aβ形成，保护神经元，进而起到防治AD的作用。

4 参考文献

1Von Bernhardi R，Eugenin J.Alzheimer′s disease：redox dysregulation as a common denominator for diverse pathogenic mechanisms〔J〕.Antioxid Redox Signal，2012；16(9)：974-1031.

2张连城，张玉莲，张 权.从肾藏精论治老年痴呆〔J〕.中医杂志，2011；17(52)：1456-8.

3潘 婕，张玉莲，张连城.从肾精与脑髓之关系论治老年痴呆〔J〕.辽宁中医杂志，2013；10(40)：2031-2.

4黎巍威，王学美.中医从“肾”防治阿尔茨海默病的现代研究〔J〕.中国实验方剂学杂志，2010；16(13)：227-31.

5卢晓沅，陈志良，王春霞.女贞子化学成分及其药理作用研究概况〔J〕.中药材，2006；6(10)：15-8.

6宋小丹，马海明，韩思莹，等.齐墩果酸对谷氨酸诱导神经细胞损伤的影响〔J〕.哈尔滨医科大学学报，2007；57(1)：13-5.

7Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease：progress and problems on the road to therapeutics 〔J〕.Science，2002；297(5580)：353-6.

8郑嵋戈，阮志刚，刘 靖，等.β-淀粉样蛋白的代谢机制〔J〕.神经解剖学杂志，2011；27(3)：344-8.

9李 拓，赵忠新.β-淀粉样肽与阿尔茨海默病〔J〕.第二军医大学学报，2010；31(10)：1133-7.