不同时间点脑出血大鼠脑组织中缺氧诱导因子1α和线粒体细胞色素C的表达

殷旭华 李冬梅 于慧玲

(内蒙古医科大学附属医院神经内科，内蒙古 呼和浩特 010050)

脑出血是发病率和致死率极高的脑血管疾病之一〔1〕。脑出血后轻微脑缺血伴随着大量激活的细胞因子外渗及血肿周围神经元死亡，是脑出血后神经细胞死亡的主要途径之一〔2〕。因此如何阻断脑出血后神经细胞凋亡成为研究热点，本实验探讨缺氧诱导因子(HIF)-1α和线粒体细胞色素(Cyt)-C在脑出血大鼠脑组织中的表达及与脑神经细胞凋亡之间的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康的Wistar老年雄性大鼠(20月龄)120只(吉林大学基础医学部动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK2007-吉大-0003)，体重(370±20)g。

1.2实验试剂及仪器 HIF-1α、Cyt-C的ELISA试剂盒购于南京建成生物有限公司；Trizol、HIF-1α和Cyt-C的引物、反转录试剂盒均购于Takara生物有限公司。Biotek Epoch酶标仪(美国)；实时荧光定量PCR仪(型号ABI7300，美国)；Biometra PCR扩增仪(美国)；脑立体定位仪(NARISH IGE SN-3型)。

1.3脑出血模型制备〔3〕采用自体尾动脉血尾状核定位注入法建立脑出血模型。动物称重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 ml/100 g)。麻醉成功后，固定大鼠，在脑立体定位仪引导下用微量进样器向尾状核(以前囟为原点R 3.0 mm，A 0.2 mm，H 5.0 mm)注入自体不加抗凝剂的尾动脉血50 μl。假手术组:尾状核部位打孔进针、不注血，其他同模型制备。

1.4实验分组 随机分为假手术组和脑出血模型组各60只；两组按时间点分组：12、24、48、72 h、5和7 d组(n=10)。

1.5大鼠脑组织中HIF-1α、Cyt-C蛋白含量的检测 采用ELISA法检测，严格按试剂盒说明书操作。

1.6大鼠脑组织中HIF-1α、Cyt-C mRNA水平的检测 取冷冻脑组织60～100 mg，用Trizol提取总RNA，应用实时多聚酶链反应(RT-PCR)法测定HIF-1α、Cyt-C mRNA的表达。根据Takara试剂盒说明书方法逆转录合成cDNA。引物序列：GAPDH(252 bp)上游5′-GACAGCAACAGGGTGGACG-3′，下游5′-GTTTGAGGGTGCAGCGAACTTG-3′；HIF-1α(198 bp)上游5′-TCAAGTCAGCAACGTGGAAG-3′，下游5′-TATCGAGGCTGTGTCGACTG-3′；Cyt-C(110 bp)上游5′-GTTGGACAGCCCCGATGTTAG-3′，下游5′-TTGAGAAAGGGAAAGGCAGTGATG-3′。

1.7统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

与假手术组比较，脑出血模型组不同时间点脑组织中HIF-1α、Cyt-C蛋白和mRNA水平均明显升高(P<0.001)，72 h达高峰，随后逐渐下调。脑出血模型组术后12、24、48 h、5、7 d与72 h HIF-1α、Cyt-C的蛋白和mRNA水平有统计学差异(P<0.01)，48 h与5 d无统计学差异(P>0.05)。见表1和表2。

表1 各组脑组织中HIF-1α、Cyt-C蛋白含量的比较 (n=10,±s,pg/ml)

表2 各组脑组织中HIF-1α、Cyt-C mRNA水平的比较 (n=10,±s)

3 讨 论

脑出血后血肿周围的继发性损伤导致神经元细胞发生坏死或凋亡。HIF-1α是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子，任何氧浓度降低的条件下都可诱导细胞快速、大量的表达，在调节缺氧诱导的基因表达中起重要作用〔4〕。HIF-1α表达增高可促进半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达，促进细胞凋亡，加重脑水肿、病理学改变和炎症反应程度及神经功能障碍〔5〕。Cyt-C是线粒体呼吸链的重要组成部分，定位于线粒体内膜上，是线粒体电子传递链的重要组成部分〔6〕。细胞凋亡是受多基因调控的程序性细胞死亡，而线粒体Cyt-C是凋亡的重要启动因子之一〔7〕。凋亡过程中通过线粒体外膜释放至胞质导致Cyt-C缺乏，从而电子传递链被阻断，导致ATP合成减少和不完全氧化造成活性氧(ROS)过度生成，导致线粒体外膜孔道的开放，进一步引发线粒体内容物的释放，从而形成一个放大效应的恶性循环〔8〕。HIF-1α与低氧促进Caspase-3的表达密切相关、Cyt-C参与细胞有氧呼吸活动并在诱导细胞凋亡方面有重要意义。本实验结果提示，脑出血后脑组织中HIF-1α、Cyt-C的蛋白及mRNA水平增高可促进神经细胞凋亡、导致神经功能障碍及加重继发性脑损伤，阻断二者的表达，为脑出血的治疗提供新的靶点。

4 参考文献

1何晓英,付 华,袁 平,等.粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠的治疗机制〔J〕.中国老年学杂志,2014；34(9):2486-9.

2李瑞瑞,庞 晓.血同型半胱氨酸与高血压患者脑出血的关系〔J〕.中华高血压杂志,2014;22(2):181-3.

3张祥建,刘春燕,祝春华,等.大鼠自体动脉血脑出血动物模型的建立〔J〕.脑与神经疾病杂志,2003;11(6): 341-4.

4郭守刚,刘庆新,黄秀梅,等.脑出血灶周缺氧诱导因子-1α的表达及其神经细胞凋亡的实验研究〔J〕.中风与神经疾病杂志,2005;22(3):224-6.

5李晓玲,王满侠,张 博,等.亚低温对脑出血后非caspase酶依赖性凋亡通路的影响〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志,2014;21(1):44-7.

6代全德,张建平,路文革,等.脑出血血肿周围脑组织细胞凋亡与细胞色素C表达的关系〔J〕.中国实用神经疾病杂志,2009;12(7):38-40.

7Matsushita K,Meng W,Wang X,etal.Evidence for apoptosis after intercerebral hemorrhage in rat striatum〔J〕.J Cereb Blood Folw Metab,2000;20(8):396-404.

8张 云,刘 斌.脑出血后继发性脑损伤的细胞凋亡机制研究进展〔J〕.中国康复医学杂志,2007;12(6):1130-3.