小鼠同种异体内皮祖细胞移植治疗急性肺损伤的相关研究

胡若愚，承燕，李好，张雷，景华，吴海卫

(南京大学临床学院,南京军区南京总医院 心胸外科，江苏 南京 210002)

急性肺损伤(acute lung injury， ALI)与急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)广泛存在于各种严重临床疾病的发生发展过程中[1]。目前认为，在ALI的发病初期，肺组织损伤的主要病理表现是肺血管内皮细胞破坏以及炎症细胞浸润。由于肺泡-毛细血管所构成的气血屏障受破坏，导致肺血管通透性的增加，使得大量组织液携带各种炎症细胞及炎症因子进入肺间质及肺泡中，并随之引发肺水肿；肺水肿又进一步加重了氧气弥散障碍并增加死腔通气量，从而导致了组织缺氧,并引起机体进一步的损伤[2- 3]。自1967年Ashbaugh等首次提出ARDS的概念后，医学工作者尝试使用了各种药物治疗该疾病，然而治疗效果仍不尽如人意[4]。

自Asahara等[5]首次报道发现外源性内皮祖细胞(EPC)以来，不断有研究揭示了EPC作为内皮细胞的前体细胞在血管新生及内皮修复中所发挥的重要作用。EPC多存在于骨髓中，并可被多种细胞因子、药物、缺血及损伤信号动员进入血液循环，参与受损组织的内皮修复及血管新生[6]。研究表明：EPC在治疗肢体缺血、心肌缺血、肾脏疾病及移植血管成活等方面均有重要而独到的作用[7- 11]。研究显示：EPC作为一种机体自身修复途径，通过迁移、黏附于血管受损部位，替代受损内皮细胞或通过其旁分泌作用产生新的细胞因子而促进内皮再生，在维持机体血管内皮修复及更新过程中发挥重要作用。不仅如此，EPC在ALI的治疗中也显示其独特的作用。Burnham等研究了ALI患者预后与循环血中EPC数量之间的关系，发现ALI/ARDS患者循环中的EPC数量增加，EPC数量高的患者预后好；同时，外周血EPC的数量可以反映炎症相关性肺损伤血管损伤的程度，并可作为评价疾病预后的指标之一[12]。根据上述研究结果，我们推测：外周血循环中的EPC数量决定了肺血管损伤后肺血管内皮的修复的速度及水平，并直接影响疾病的进展和预后。然而，由于生理状态下，外周血循环中EPC含量极低，仅占外周血单核细胞总量的0.002%[13]，因此，进行EPC移植治疗是迅速提高外周血循环中EPC水平直接而有效的途径。

本研究中，我们以转基因EGFP- BALB/c小鼠作为细胞供体，自骨髓单核细胞分离、培养获得EGFP- EPC，并在体外大量扩增后，回输至由内毒素(lipopolysaccharide，LPS)诱导的野生型BALB/c小鼠ALI模型体内。试图通过外源性EPC移植治疗加速ALI小鼠肺血管损伤修复进程，改善其预后。同时应用荧光显微镜观察输入的外源性EGFP- EPCs在受体鼠体内迁移及归巢情况,并通过组织病理学检查、肺组织湿干重比、肺组织微血管再生情况等检测手段，综合评价外源性EPC移植对ALI的治疗效果，为临床使用EPC治疗ALI提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及主要仪器

野生型BALB/c小鼠18只，雄性， 5～7周龄，体重21～25 g，由南京军区南京总医院比较医学科提供，恒温、清洁环境饲养，不限食水。转基因EGFP- BALB/c小鼠30只，雄性，5～7周龄，体重18～23 g，与所用的野生型BALB/c小鼠属同一祖系，平行传代，由南京军区南京总医院比较医学科提供，恒温、清洁环境饲养，不限食水。LPS(Escherichia coli O55:B5，美国Sigma- Aldrich公司)，人纤维连接蛋白(美国R&D公司)，小鼠淋巴细胞分离液(美国Sigma- Aldrich公司)，大鼠抗小鼠CD34单克隆抗体(ab815，英国Abcam公司)，羊抗大鼠IgG- FITC抗体(sc- 2011，美国Santa Cruz公司)，超净工作台(苏净集团)，细胞培养箱(美国Thermo公司)，荧光倒置显微镜(日本Olympus IX71型)。

1.2 小鼠骨髓源性EPC的分离与培养

每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉并处死后于75%酒精中浸泡30 min。于超净工作台上将小鼠双下肢股骨、胫骨分离并取出，以1 ml注射器吸取PBS冲洗小鼠胫、股骨骨髓腔，密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞，细胞计数后，以5×106·孔-1细胞量将细胞接种于人纤维连接蛋白包被的6孔培养板中，每孔内加EGM- 2 Single Qutos培养液2 ml。将细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，细胞接种后第4天首次更换细胞培养液，弃去未贴壁细胞，将贴壁细胞继续培养。此后每2 d更换培养液1次。细胞培养3周，每日观察细胞生长状态，并拍照留存。

1.3 ALI小鼠模型制作及分组

野生型BALB/c小鼠行戊巴比妥腹腔注射麻醉，颈部脱毛并以75%酒精消毒术野。于小鼠颈部正中行长约0.5 cm切口。钝性分离小鼠颈部肌肉，暴露气管。以1 ml注射器吸取预先配制好的LPS溶液50 μl，经小鼠气管内滴注。滴注时，抬高操作台成45°角，使LPS溶液顺气管流入小鼠肺部。滴注后，将小鼠直立并旋转，使LPS在肺内尽量均匀分布。其后以丝线缝合小鼠颈部切口。受体BALB/c雄性小鼠共18只，随机分为3组，每组6只。分别为：假手术组 (经气管内滴注50 μl PBS，其后30 min经尾静脉注射100 μl PBS)、ALI组(经气管内滴注5 mg·kg-1LPS，体积为50μl，30 min后经尾静脉注射100 μl PBS)、EPC治疗组(经气管内滴注5 mg·kg-1LPS，体积为50 μl，30 min后根据受体小鼠体重经尾静脉注射EGFP- EPCs细胞悬液，注射细胞量为5×104·g-1)。各组小鼠均饲养至术后3 d处死，留取肺组织标本。

1.4 移植受体小鼠肺组织中外源性EPC的表达

迅速打开处死后BALB/c小鼠的胸腔，摘取左上肺,以OCT包埋小鼠肺组织，置于冰冻切片机中-18 ℃速冻后行5 μm切片，并迅速于荧光显微镜下观察并拍照。

1.5 移植受体小鼠肺损伤程度评估

1.5.1 肺组织病理切片观察及肺损伤评分 BALB/c小鼠处死后，迅速摘取其左下肺组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋、脱水后切片，行苏木素- 伊红染色，中性树脂封片后于显微镜下观察并拍摄照片。将各组小鼠肺组织HE切片与光学显微镜下观察并行双盲评分。评分指标包括肺泡组织结构、肺间质及肺泡内出血情况、肺间质及肺泡内炎症细胞浸润情况、肺泡内透明膜形成程度。4项指标以0～4分进行半定量分析，累积评分为该切片肺损伤指数评分。

1.5.2 肺组织湿干重终比测定 实验动物分组及动物模型制作方法同前。预先留取的小鼠右侧肺组织，以微量天平称量小鼠右肺质量。此后将肺组织放入烘箱内50 ℃烘焙24 h取出。再次称量小鼠肺干重。小鼠肺部湿干重比计算方法为：湿干重比=(肺湿重-肺干重)/肺干重×100%。

1.5.3 移植受体小鼠肺组织新生微血管密度(MVD)测定 以CD34为新生血管标记物。将移植受体小鼠肺组织行石蜡切片后进行CD34免疫组化染色，细胞棕褐色染色为CD34表达阳性。各组BALB/c小鼠中，每组随机选取4个样本，每只小鼠对应免疫组化染色切片选取2张。先于低倍镜下选取CD34表达阳性率最高部位作为检测部位,然后光镜400倍选取该区域5个视野拍摄。统计每张照片1 mm2区域中CD34阳性染色的微血管数量，其平均值为该组小鼠肺组织切片所对应的MVD值。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 EGFP- EPCs的培养

EGFP- EPCs分离、培养方法与自野生型BALB/c小鼠骨髓单核细胞分离、培养EPCs方法完全相同。在培养过程中我们发现，所培养的EGFP- EPCs生长、增殖能力与普通EPCs相同，细胞早期呈集落样生长状态(图1A)，细胞培养至3周后，细胞生长呈现铺路石样状态(图1B)。

图1EGFP-EPCs荧光显微镜下照片A.早期EGFP- EPC呈集落样生长状态;B.晚期EGFP- EPCs于荧光显微镜下呈现“铺路石”样生长

Fig1EGFP-EPCsobservedunderfluorescentmicros-copeA.Early EGFP- EPCs exhibited a colony- forming appearance;B.Late EGFP- EPCs exhibited a cobblestone- like appearance

2.2 肺组织冰冻切片观察细胞移植受体小鼠肺组织中外源性输入EGFP- EPC

荧光显微镜下观察各组受体小鼠肺组织冰冻切片中输入的EGFP- EPCs荧光表达情况。发现接受外源性EGFP- EPCs治疗的荧光小鼠组肺组织冰冻切片内肺血管内壁上附着有明显的绿色荧光层(图2A)。而假手术组(图2B)及ALI组(图2C)中则无法观测到明显的绿色荧光表达。该结果提示：外源性输入的EGFP- EPCs可随血液循环定向迁移至受损肺血管内皮部位，与之黏附从而发挥内皮治疗作用。

2.3 各组小鼠肺组织HE切片检查及各组肺损伤评分结果

HE切片显示：假手术组肺泡结构完整，肺泡腔及肺间质内未见明显炎症细胞浸润、出血及透明膜形成征象(图3A)。LPS可致严重的肺组织损伤，表现为肺泡结构的破坏、肺泡腔减小、肺泡腔及肺间质内出血、炎症细胞浸润、肺泡透明膜形成等(图3B)。EPC治疗组的肺组织病理切片较之ALI对照组损伤程度明显减轻，肺泡结构基本维持，炎症细胞浸润及肺组织充血程度也有明显降低(图3C)。肺损伤指数评分显示：LPS诱导的ALI明显增加了肺组织损伤指数评分，差异有统计学意义(10.83±1.17vs1.17±0.98，P<0.001)，EPC治疗组肺损伤程度显著降低(7.67±1.21vs10.83±1.17，P=0.003)，但较假手术组仍明显增高(7.67±1.21vs1.17±0.98，P<0.001)(图4)。

图2EPC治疗组(A)、假手术组(B)、ALI组(C)肺组织冰冻切片于荧光显微镜下照片箭头所指为肺血管内膜上明显的绿色荧光信号，提示移植的EGFP- EPC细胞可定向黏附于受损的肺血管内膜表面

Fig2LungtissuefrozensectionsfromEPCgroup(A),shamgroup(B),ALIgroup(C)

图3各组小鼠肺组织HE染色切片A.假手术组;B.ALI组;C.EPC组

Fig3HEstainingoflungtissuesA.Sham group;B.ALI group;C.EPC treatment group

图4肺损伤指数评分与假手术组比较，aP<0.01；与ALI组比较，bP<0.01

Fig4DeterminationoflunginjuryscoresCompared with the sham group， aP<0.01; compared with ALI group，bP<0.01

2.4 各组小鼠肺湿干重比测定

肺湿干重比ALI组较假手术组明显增高 [(72.17±5.98)%vs(23.00±3.74)%，P<0.001]。而EPC治疗组较ALI组明显降低(61.67±6.25%vs72.17±5.98%，P<0.05)，但仍明显高于假手术组 (61.67±6.25%vs23.00±3.74%，P<0.001)(图5)。

图5肺组织湿干重比测定与假手术组比较，aP<0.01；与ALI组比较，bP<0.01

Fig5DeterminationoflungwettodryratioCompared with the sham group,aP<0.01;compared with ALI group，bP<0.01

2.5 移植受体小鼠肺组织MVD测定

假手术组与ALI组比较，新生血管的MVD值极低，差异有统计学意义(P>0.05)，而EPC治疗组新生血管密度明显增加，与其他两组比较差异均有统计学意义(P<0.001)(图6)。

图6CD34免疫组化染色肺MVD测定与假手术组比较, aP<0.01；与ALI组比较，bP<0.01

Fig6DeterminationofCD34immunostainingMVDCompared with the sham group，aP<0.01;compared with ALI group，bP<0.01

3 讨 论

肺血管内皮损伤是ALI/ARDS发病的始动因素[14]，如能在ALI发病早期对受损的肺血管内皮进行快速而有效的修复，则可以从源头上阻止疾病的进一步发展,从而提高治愈率。随着对ALI/ARDS研究的不断深入以及干细胞治疗技术的兴起，人们逐渐发现，EPC细胞治疗作为一种全新的治疗方法，可能是ALI/ARDS治疗的新思路[15- 16]。EPC主要存在于人体骨髓中，在损伤、缺氧、细胞因子以及药物等作用因素的动员下进入血液循环，并有着向受损器官及组织定向迁移的特性。研究表明，EPC不仅能够以“嵌合”的方式直接参加受损血管部位内皮损伤修复，替代坏死或凋亡的内皮细胞，还能够发挥旁分泌作用，促进内皮损伤的修复和血管的新生[17- 19]。而更有研究表明，体内EPC的水平与ALI/ARDS的病程进展及预后密切相关。Burnham与Yamada均研究了外周血中EPC水平及集落形成能力与患者ALI/ARDS预后的相关性，并得出了一致的结论。他们的研究认为：ARDS发生时，如果内体内EPC水平过低或活力低下，往往预后不佳。因此，EPC 已成为反映ALI血管损伤程度的指标之一，同时也是对炎症预后判断的重要预警指标[20- 22]。对于上述现象，Denburg等[23]提出，炎症反应时释放的炎症介质及多种未知因素动员骨髓的EPC 进入外周循环感知损伤，并通过动员和迁移到达受损部位，修复血管内皮，形成新生血管，恢复局部血流，促进组织结构和功能的修复。然而，在生理状态下EPC的水平极低，一旦机体遭受重大打击，体内的EPC往往不能及时满足机体血管损伤修复的需要。因此，EPC移植作为利用EPC治疗疾病的有效手段，被人们逐渐认识和重视。

近几年，已有学者开始尝试通过自体EPC体外扩增后回输至ALI动物模型体内进行ALI/ARDS治疗，并已取得明显的治疗效果[24- 25]。但从临床实用角度考虑，自体细胞回输往往不符合临床实际工作需要：由于ALI/ARDS发病的突然性，患者很少有机会预留干细胞以备临床治疗之需。而EPC抗原性相对较弱，机体排斥反应较轻，因此，同种异体EPC移植可能是更为有效并切合临床实际工作需要的治疗方法。与此同时，人们发现EPC至少存在2种细胞亚型：早期EPC和晚期EPC。在细胞的生长、增殖、成血管能力等方面，晚期EPC均明显优于早期EPC。因此，晚期EPC被认为具有更加广泛和美好的治疗前景[26]。然而，由于对晚期EPC的研究和报道相对较晚，目前尚未见有明确使用晚期EPC治疗ALI/ARDS的研究报道。本研究使用培养超过3周的晚期EPC作为移植细胞治疗ALI/ARDS，在细胞体外扩增、培养的过程中，细胞生长方式呈现典型的“铺路石”样生长排列，且细胞增殖速度较早期EPC明显加快，符合晚期EPC的生长特点。实验结果表明：使用这种晚期EPC进行细胞移植治疗，能够明显改善LPS所诱导的肺组织损伤，维持肺血管内皮的完整性，减少肺泡结构的破坏以及炎症因子向肺间质和肺泡内的聚集。

为了有效地对输入体内的外源性内皮祖细胞进行细胞示踪，我们选用了转基因EGFP- BALB/c小鼠作为细胞供体。该种型小鼠基因中含有EGFP基因，其有核细胞均表达EGFP蛋白，于荧光显微镜下发出耀眼的绿色荧光，信号强度高且稳定，并可完全避免细胞标记过程中对细胞活性的损伤。此外，由于EGFP基因在EGFP- EPC中稳定表达，不受细胞增殖及分化的影响，因此，能够更全面、客观地反映出外源性细胞在体内的增殖及分化情况。我们的研究表明：外源性输入的EGFP- EPCs能够在肺血管内大量定植，并黏附于血管壁内膜上，反映出输入体内的外源性EPC向受损组织及器官趋化的特性。CD34免疫组化染色多用于反映组织内新生血管的情况。在本研究中，通过使用CD34抗体标记的肺组织切片观察，并统计单位面积内阳性标记的微血管数量，我们发现：无论是假手术组还是ALI组，其肺组织上CD34的表达均极低，而进行细胞移植的受体鼠肺组织切片上，可看到明显的阳性标记，差异显著。该现象从侧面提示我们：在机体遭受重大打击时，自身骨髓的EPC动员是非常有限的，往往不能够满足急性打击下机体自身修复的需要，因此更凸显出外源性EPC移植在ALI/ARDS这种突发打击下迅速提高血循环内EPC水平、满足机体修复需要的重要而独特的优势。

综上所述,使用外源性EPC移植治疗ALI/ARDS，能够有效地修复受损肺血管内皮细胞，维持肺泡- 毛细血管气血屏障的完整性，减少炎症细胞及炎症因子向肺间质及肺泡内浸润，从而加速受损肺组织内的内皮修复及血管新生，并最终减轻肺损伤。

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