依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮层细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

杨东娜 白 洋 王 策

(沈阳市第五人民医院，辽宁 沈阳 110023)

脑血管病具有发病率高、致残率高的特点，其中缺血性脑血管病约占脑血管病的80%。脑缺血再灌注后神经细胞发生坏死和凋亡，坏死区的神经细胞由于完全性缺血发生不可逆的死亡，而缺血半暗带区仍有可存活的神经元，通过细胞凋亡形式损伤，这部分神经元的损伤是可逆性的，通过影响细胞凋亡而保护这部分神经元是治疗缺血性脑血管病的关键。

1 材料与方法

1.1实验动物 Wistar雄性大鼠135只，体重240～280 g，3～4月龄，由长春市高新开发区动物中心提供。合格号为(吉)2010-2011。

1.2药物和试剂 10%水合氯醛(吉林大学第一医院药剂科生产)，氯化红四氮唑(TTC，国药集团试剂有限公司生产)，Caspase-3 mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，抗体用兔抗大鼠Caspase-3抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，4%多聚甲醛(北京化学试剂公司生产的粉末自己配制)TUNEL凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色液(吉林大学基础医学部病理实验室提供)，图像分析仪(HMIAS-2000医学图文分析系统)，生物显微镜(OLYMPUS CX31)。依达拉奉注射液：昆明积大制药有限公司。

1.3动物模型制备 采用改良的Zea Longa线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠术前禁食12 h,不禁水，10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g体重给予大鼠腹腔注射麻醉后取仰卧位固定，常规备皮消毒，待大鼠的全身肌肉松弛后开始手术，采用直径为0.234 mm的断端打磨光滑的尼龙鱼线。手术全程尽量保证无菌操作，术后用庆大霉素注射液冲洗手术创口后逐层缝合，栓线尾端外露部分标记，术后大鼠放置在烤灯下保温，保证术后肛温36.5～37.5℃，增加大鼠的术后存活率。术后的大鼠进行Longa等〔1〕神经缺损功能评分:0分：无神经系统损伤体征；1分：不能完全伸展右侧前爪；2分：行走时向右侧转圈；3分：站立不稳，向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。功能评分1～3分为模型成功，如实验有死亡的鼠，取同批次的鼠补足。在缺血后2 h小心外拉栓线约1 cm使其断端回至CCA内，形成再灌注。假手术组将尼龙线仅留在颈内动脉而不入颅，2 h后，将尼龙线拉回至颈外动脉处。依达拉奉组在再灌注后1、1.5 h在腹腔内注射依达拉奉注射液(按照3 mg/kg)2次。每组各45只。分别于再灌注后6、12、48 h处死大鼠。术后假手术组和模型组大鼠各分成3组，分别检测脑梗死体积、缺血区神经细胞凋亡情况和缺血区Caspase-3蛋白表达。

1.4梗死体积测定 各组大鼠分别在再灌注后6、12、48 h时间点断头处死，3 min内取脑，把脑取出后去掉小脑、低位脑干和前部嗅球，保留大脑半球，从前到后每隔2 mm切为厚薄均匀的5～6片。置于2%TTC中37℃水浴30 min左右。可见正常脑组织着色为深粉红色，梗死部分不着色为白色。用数码相机拍照后输入计算机，用图像分析软件计算梗死面积。

1.5检测缺血区TUNEL法检测神经细胞凋亡情况 各组大鼠分别在再灌注6、12、48 h麻醉，打开胸腔，完全暴露心脏，由左心室插入20号针头，剪开右心耳，生理盐水灌注后见大鼠四肢、眼睛、口唇黏膜逐渐变为白色，右心耳流出澄清液体后继续用4%多聚甲醛250 ml灌注固定，可见灌注过程中大鼠的四肢及头尾逐渐僵硬。5 min内取脑，去掉小脑、低位脑干和前部嗅球后放入新鲜配置的4%多聚甲醛中固定至少24 h。固定后的脑从前到后每隔2 mm切5～6片，取中间一片常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。包埋后组织块连续冠状切片，片厚约7 μm，买个鼠脑取2张切片TUNEL法检测凋亡。

1.6缺血再灌注后Caspase-3表达 各组大鼠制备模型及取材同TUNEL检测神经凋亡细胞组，石蜡切片常规脱蜡后严格按照试剂盒的说明书进行操作。胞浆被染成棕褐色为阳性细胞。应用MetaMorph显微图像分析系统测定额顶叶皮质神经细胞胞浆的灰度值，染色越深，其值越小，反映胞质内蛋白表达越高，每张切片随机选择5个视野检测灰度值和计数阳性细胞，取其平均值代表每只大鼠的阳性表达程度。

2 结 果

2.1不同时间点各组大鼠脑梗死体积 假手术组各时间点大鼠未见脑梗死发生。与假手术组比较，模型组各时间点脑梗死体积均有明显增高(P<0.05)，模型组随梗死时间的延长，梗死体积也随之增加(P<0.05)，使用依达拉奉治疗后，各时间点梗死体积均明显减小(P<0.05)。见表1。

2.2不同时间点各组大鼠神经细胞凋亡情况 假手术组各时间点大鼠仅见微量神经细胞凋亡出现。与假手术组比较，模型组各时间点大鼠神经细胞凋亡明显增多(P<0.05)，且在再灌注12 h后神经细胞凋亡最明显(P<0.05)，使用依达拉奉治疗后，各时间点梗死体积均明显减小(P<0.05)。见表2。

2.3不同时间点各组大鼠脑组织Caspase-3表达 与假手术组各时间点比较，模型组大鼠脑组织Caspase-3表达明显增多(P<0.05)，使用依达拉奉治疗后，各时间点大鼠脑组织Caspase-3表达明显下降(P<0.05)。见表3。

表1 各组大鼠各时间点脑梗死体积

表2 各组大鼠各时间点神经细胞凋亡情况

表3 各组大鼠各时间点脑组织Caspase-3表达

3 讨 论

目前认为在梗死中心神经细胞死亡的形式为坏死，而导致梗死半暗带神经细胞损伤的形式为细胞凋亡〔2〕。细胞发生凋亡还是死亡由多种因素决定，包括损伤程度、Ca2+超载程度、细胞内ATP水平以及Caspase-3激活程度。凋亡细胞主要存在于缺血半暗带，提示凋亡可能影响最后脑梗死的面积〔3〕。而在缺血再灌注后0.5 h可出现凋亡细胞，24～48 h达到高峰，最长可持续到28 d。凋亡细胞的数量随缺血时间的延长而增多〔4～6〕。凋亡是各种凋亡刺激信号使动，受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径等调控的瀑布式级联激活过程，其中蛋白酶与细胞凋亡密切相关。而凋亡的发生由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。Caspase家族在凋亡细胞的死亡中扮演了重要角色。Caspase-3酶原与CED-3蛋白有35%的一致性，58%的相似性，Caspase-3是Caspase家族中14个成员中，与凋亡关系最密切的，是Caspase级联瀑布反应下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种因素的凋亡程序中起最后枢纽作用。

随着对脑缺血再灌注损伤病理生理机制的研究，目前认为脑缺血再灌注可引起脑内一系列的生化改变，其中自由基过量蓄积是造成脑缺血再灌注后神经组织损伤的重要环节，这已被广泛认可〔7〕。依达拉奉是目前唯一在临床上使用的自由基清除剂，实验证明依达拉奉具有以下功能：清除缺血/再灌注后脑内具有高度毒性的羟基集团，一直脑缺血后梗死区迟发性神经元死亡，一直脂质过氧化，缩小梗死体积，抑制炎症介质白三烯的形成，减轻脑水肿，减少细胞凋亡。

本研究结果显示随着再灌注后时间的推移，凋亡细胞数逐渐增加，梗死体积增大，Caspase-3蛋白表达增多，提示神经元凋亡数增加以及Caspase-3蛋白表达增加与梗死体积增大有明显的相关性。

4 参考文献

1Longa EZ，Weinstein PR，Calson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20：84.

2Kogure T，Kogure K.Molecular and biochemic events within the brain subjected to cerebral ischemia targets for therapeutical intervention 〔J〕. Clin Neurosci，1997;4 (3)：179-83.

3Guegan C，Boutin H，Boudry C,etal.Apoptotic death in cortical ileuroils of mice subjected to focal ischemia〔J〕.C RA Cad Sci，1996;19 (10) ：879-85.

4Rami A，Jansen S，Giesser L,etal.Post-ischemic activati on of caspase-3 in the rat hippocampus：evidence of an axonal and dendritic iocalization〔J〕.Neurochem Int，2003；43(3)：211-23.

5吴 旭，王保捷，张国华，等.大鼠脑损伤后Caspase-3表达的时间规律性研究〔J〕.中国医科大学学报，2004；33(4)：324-7.

6王宇卉，邵福源，夏春林，等.大鼠大脑中动脉缺血-再灌注模型中Caspase- 3的表达〔J〕.临床神经病学杂志，2003;16(4)：214-9.

7Sweeney ML.Neuroprotective effects of adenosine incerebral ischemia：window of opportunity〔J〕. Neurosci Biobehav Rev,2004;21(2):207.