石菖蒲有效成分对抑郁模型大鼠海马神经元的保护作用

高志影 张 春 董海影 刘得水 李公启 张静艳 孙玉荣 柏青杨 王绍清 张晓杰

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 151100)

“抑郁症海马神经元再生障碍假说”的提出是近年来抑郁症病因学研究最具突破性的进展之一，该假说认为抑郁症的发生与神经系统可塑性失调密切相关，表现为神经损伤与神经发生障碍〔1〕。因此，激活海马区内源性神经前体细胞、促进成年脑神经元再生可能为抑郁症的治疗带来突破性的变革。环磷酸腺苷反应原件结合蛋白(CREB)作为核内第三信使之一，在神经发生及神经可塑性形成中发挥重要作用，CREB介导的转录变化与中枢神经系统疾病关系密切，如认知功能减退、抑郁和脑缺血等〔2,3〕，鉴于其在神经元功能和结构可塑性调节中的重要作用，CREB也是抗抑郁治疗的重要靶点之一〔4〕。石菖蒲在我国被用于治疗脑部疾病，抗抑郁作用具有很好的临床基础〔5,6〕，而其主要有效成分β-细辛醚极易透过血脑屏障进入大脑。本研究进一步深入探讨β-细辛醚促进抑郁大鼠海马神经重塑的关键环节。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 4～5月龄清洁级SD雄性大鼠60只，体重200～220 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(辽)2008-0002。

1.1.2药品 β-细辛醚由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取；盐酸氟西汀 (苏州俞氏药业有限公司，100201)。

1.1.3试剂与仪器 AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BIPE公司)；SP免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程科技公司)。FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，EM208S透射电子显微镜(荷兰菲利浦公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组 动物适应性喂养1 w，通过敞箱实验剔除不足30次或超过120次的大鼠，随机分为正常对照组、模型组、西药对照组和中药组共四组，每组15只。

1.2.2造模方法 模型组、西药对照组和中药组单笼饲养，同时进行21 d的慢性轻度不可预见性应激刺激：电击足底(电流强度1 mA，电压45 mV，持续时间10 s/次，共30次)、摇晃(1次/s,15 min)、冰水游泳(4℃,5 min)、热应激(45℃,5 min)、夹尾(3 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、束缚(8 h)、昼夜颠倒、倾斜鼠笼与潮湿垫料(100 g垫料中加入200 ml水)。

1.2.3给药方法 造模同时，中药组按25 mg·kg-1·d-1灌胃给予β-细辛醚，1次/d，连续21 d。西药对照组按1.2 mg·kg-1·d-1灌胃给予氟西汀，1次/d，共21 d。

1.2.4抑郁模型大鼠行为学评价 Open-field测定方法：实验装置为高40 cm、底边长80 cm、周壁涂黑、底板白色的无盖方箱，底板用黑线划成16 cm×16 cm的25个方格。以大鼠穿越底面格数为水平活动得分，大鼠3只脚以上均在同一格子内为一格，穿越一格计1分，如大鼠沿线行走，以每10 cm为1分；以大鼠直立次数为垂直活动得分，双足离开底面为标志。

糖水偏爱度的测定：24 h禁食禁水后，测定1 h动物饮用1%蔗糖水和纯水的量，应用公式：1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+纯水消耗量)×100%，计算各组大鼠糖水偏爱度值。

1.2.5免疫组化法检测大鼠海马区CREB蛋白的表达 大鼠灌注固定，断头取脑，分离海马，固定，包埋，切片，加抗体，显色，复染，脱水，封片，光镜下观察并用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统计算积分光密度。

1.2.6RT-PCR检测大鼠海马区CREB mRNA的表达 分离海马，提取RNA，检测RNA纯度及完整性。使用Sequence Detection software version 1.2.3软件分析各标本的循环阈值(Ct 值)。采用ΔCt法计算实验结果，以2-ΔCt为 mRNA 的相对浓度，实验组与对照组 mRNA 相对浓度的比值为实验组mRNA表达相对于对照组的倍数。CREB 引物：前向5′-ACAGATTGCCACATTAGC-3′;后向,5′-CTCCTCCCTGGGTAATGG-3′。

2 结 果

2.1各组大鼠行为学评价结果 见表1～表3。

2.2β-细辛醚对大鼠脑CREB mRNA及蛋白表达的影响 见表4,图1。

表1 各组大鼠Open-Field实验水平运动结果比较

表2 各组大鼠Open-Field实验垂直运动结果比较

表3 各组大鼠糖水偏爱度值比较

表4 各组大鼠脑CREB mRNA及蛋白表达比较

图1 免疫组检测各组大鼠海马CREB蛋白表达

3 讨 论

中药在治疗情志性疾病方面有自己独特的理论体系，也积累了不少临床上有效的方药。石菖蒲为天南星科植物石菖蒲的干燥根茎，具有化湿和胃、开窍豁痰、醒神益智之功效，其挥发油中的主要成分：α-细辛醚(约占3.4%～13.7%)和β-细辛醚(约占63.2%～81.2%)具有较强的活性，被认为是其药理作用的主要物质基础〔7〕。现代药理研究表明，石菖蒲具有较好的抗抑郁作用，石菖蒲水煎剂和氟西汀均可对抗小鼠、大鼠的失望行为，使实验动物的绝望行为降低，具有显著的抗抑郁效果〔8〕，但是究竟石菖蒲的哪一种化学成分在起作用目前仍不清楚。按照现代药学及中药现代化的要求，明确药物主要活性成分是保证药物安全、有效及质量稳定与可控的必要条件之一。因此，有必要对其有关化学成分进行深入研究。研究发现，大脑是β-细辛醚的重要分布器官，β-细辛醚极易透过血脑屏障进入大脑，在脑内的半衰期比其他器官长，这也为阐明β-细辛醚对大脑的药理作用提供了依据。

本实验表明β-细辛醚可明显改善抑郁症模型动物的行为障碍表现。CREB活性被激活，调节多种基因的转录，参与神经元的兴奋、发育、凋亡以及突触可塑性等多个神经过程，是调节中枢神经系统功能的关键性因子之一，为抗抑郁剂受体后的共同靶标，其功能的调节代表着各种抗抑郁剂激发的信号通路的交汇点〔9〕。β-细辛醚能够上调CREB蛋白和 mRNA的表达，提示该药抗抑郁作用可能与调节受体后cAMP-PKA-CREB信号通路有关。β-细辛醚对抑郁症模型大鼠的行为障碍具有明显改善作用，并可促进海马区CREB蛋白和mRNA的活性和表达，进而减少神经细胞凋亡。因此，抑制抑郁症神经元凋亡可能为β-细辛醚抗抑郁症的作用机制之一。

4 参考文献

1Thomas RM,Peterson DA. A neurogenic theory of depression gains momentum〔J〕.Mol Interv,2003；3(8):441-4.

2Ren X,Dwivedi Y,Mondal AC,etal. Cyclic-AMP response element binding protein (CREB) in the neutrophils of depressed patients〔J〕.Psychiatry Res,2011；185(1-2):108-12.

3Oury F,Yadav VK,Wang Y,etal. CREB mediates brain serotonin regulation of bone mass through its expression in ventromedial hypothalamic neurons〔J〕. Genes Dev,2010；24(20):2330-42.

4Qi X,Lin W,Li J,etal. Fluoxetine increases the activity of the ERK-CREB signal system and alleviates the depressive-like behavior in rats exposed to chronic forced swim stress〔J〕.Neurobiol Dis,2008；31(2):278-85.

5陈新俊，程黎晖. 石菖蒲的药理作用和临床应用探讨〔J〕.中草药，2007；38(5)：附1-3.

6周 鲁，张卫华，曾令航，等. 老年性痴呆的复方用药规律研究〔J〕.辽宁中医杂志，2005；32(3)：243-4.

7魏 刚，方永奇，柯雪红，等. 石菖蒲开窍醒神物质基础的药学系列研究〔J〕.中国中医药信息杂志，2005；12(8)：51-3.

8甘火荣，李明亚，李娟好，等. 石菖蒲几种粗提取物的抗抑郁作用〔J〕.广东药学院学报，2004；20(2)：141-4.

9Zhang QG,Han D,Hu SQ,etal. Positive modulation of AMPA receptors prevents downregulation of GluR2 expression and activates the Lyn-ERK1/2-CREB signaling in rat brain ischemia〔J〕.Hippocampus,2010；20(1):65-77.