肾气丸对衰老大鼠睾丸抗氧化能力和生精细胞凋亡的影响

吴正平

(宜春学院美容医学院，江西 宜春 336000)

中医对人体衰老认识历史悠久,已经形成了较完整的中医衰老理论体系,其中肾虚被认为是衰老的根本〔1，2〕。《素问》曰:“丈夫五八,肾气衰,发堕齿槁；七八肾脏衰,形体皆极”；《医学正传》“肾气盛则寿延,肾气衰则寿夭”，均明确指出了肾中精气的虚衰与机体衰老的密切关系。肾气丸是《金匮要略》中治疗肾虚证的经典方，此方阴阳双补，肾虚得复，元气充足,从而激发和推动全身各脏腑组织器官的生理功能,延缓衰老。性的变化是人体衰老的重要特征，由于肾气的不足，男子睾丸、女子卵巢以及其他有关内分泌腺体的衰退是非常明显的〔1〕。本研究采用D-半乳糖(D-gal)衰老大鼠模型，观察肾气丸对衰老大鼠睾酮水平、睾丸组织抗氧化能力和生精细胞凋亡的影响，探讨肾气丸延缓性腺衰老的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物与分组 选用清洁级Wistar大鼠40只(南昌大学医学院动科部提供，合格证号：赣医动字第02196-02)，体重180～200 g，雄性，随机分为4组：正常组，亚急性衰老模型组，肾气丸低、高剂量组。

1.2药品制备 肾气丸按8:4:4:3:3:3:1:1的比例取干地黄，山茱萸，山药，茯苓，泽泻，牡丹皮，附子，桂枝，煎煮过滤，滤液浓缩成含生药1.5g/ml溶液。

1.3试剂与仪器 D-gal为北京化学试剂公司产品；睾酮试剂盒由北京北方生物技术研究所提供；SOD、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。紫外-可见分光光度计(日本岛津，型号：UA-240)；酶标仪(美国伯乐，型号：680型)；显微镜(日本OLYMPUS，型号：BX53)。

1.4方法

1.4.1造模 除正常组无菌操作颈背部皮下注射生理盐水外，其他3组颈背部皮下注射D-gal 100 mg·kg-1·d-1，1次/d，连续42 d，造成亚急性衰老大鼠模型。

1.4.2给药 在造模的同时，肾气丸低、高剂量给药组大鼠分别灌胃相应剂量肾气丸液：5.0、10.0 g·kg-1·d-1，1次/d；正常组、模型组灌以等量生理盐水。

1.4.3血清睾酮含量测定 各组大鼠于第42天末次给药2 h后，眼球后静脉丛毛细管取血，静置后3 500 r/min离心10 min，取血清备用。严格按试剂盒操作程序测定血清睾酮含量。

1.4.4睾丸组织SOD、MDA含量测定 取血后断头处死大鼠，取单侧部分睾丸组织(约100 mg)，滤纸吸干，迅速冰浴，制成10%的组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清备用。严格按照试剂盒说明书操作测定SOD、MDA含量。

1.4.5凋亡细胞的检测 取另一侧睾丸,甲醛固定，过夜,常规石蜡包埋、切片,以TUNEL法行凋亡细胞检测，阳性细胞显示棕黄色。任取显微镜下10个视野,计算含凋亡细胞的阳性曲细精管数；再计算10个阳性曲细精管中的总细胞数和阳性细胞数,计算凋亡细胞的百分比。

2 结 果

2.1一般状态 对照组大鼠精神状态好、反应敏捷、毛发光泽顺滑。模型组大鼠均出现团居、嗜卧、精神萎靡、行动迟缓、毛色干枯等症状，与对照组比较，有显著差异。肾气丸组大鼠上述表现与模型组比较有所改善。

2.2大鼠血清睾酮和睾丸组织SOD、MDA含量变化 与正常组比较，模型组大鼠血清睾酮和睾丸组织SOD水平显著下降(P<0.01)，睾丸组织MDA水平显著升高(P<0.01)；肾气丸组与模型组比较，大鼠血清睾酮和睾丸组织SOD水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，睾丸组织MDA水平明显下降(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清睾酮和睾丸组织SOD、MDA含量变化

2.3大鼠睾丸生精细胞凋亡情况 各组大鼠的睾丸生精细胞均有凋亡现象,模型组大鼠睾丸组织凋亡细胞以成簇形式存在,而正常组和肾气丸组凋亡细胞单个散在。与正常组比较，模型组大鼠凋亡曲细精管数和凋亡细胞百分率均显著升高(P<0.01)；肾气丸组比较模型组，大鼠凋亡曲细精管数和凋亡细胞百分率均明显降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠睾丸生精细胞凋亡情况

3 讨 论

组织细胞老化、器官功能下降是随着年龄增长而逐渐出现的机体衰老现象。大量研究证实性腺功能与机体的衰老程度有着密切关系〔3〕。随着机体的衰老,睾丸的结构和功能也出现衰退。法国医学家Brown Sequard的研究显示睾丸提取液具有延缓衰老的功效,以及性激素替代疗法成为诸多老年性疾病的治疗方法也给以上观点提供了理论依据。

睾酮在维持生精功能、促进生殖器官的生长发育方面起着重要作用，其分泌受下丘脑-垂体的调节。衰老时，在下丘脑、垂体功能衰退的影响下,老年男性Leydig细胞功能降低,导致睾酮合成和分泌能力下降,表现为血清睾酮水平降低〔4〕。同时，睾酮水平的降低明显增加生精细胞的凋亡〔5〕。

衰老的自由基理论1965年由Harman提出〔6〕，已得到现代医学界的普遍认同。该理论认为，生物体内存在着产生和消除自由基的平衡体系，随着生物体年龄的增长，体内自由基的产生与消除平衡失调，自由基的产生大于消除，过多的自由基持续地攻击细胞，使细胞受到损伤，这种损伤积累到一定的程度最终引起机体衰老。因此，衰老是机体内抗氧化酶的活性不断下降而使自由基逐步积累过剩的结果。SOD是体内主要的抗氧化酶，广泛存在于机体内的各组织中。SOD能催化超氧阴离子发生歧化反应，使其生成H2O2，H2O2进一步转变成H2O和O2,从而清除自由基。MDA是动物体内脂质过氧化反应的终产物，其含量能客观反映机体组织细胞的脂质过氧化程度和自由基的产生情况〔7〕。因此,机体组织SOD、MDA可作为评价动物的衰老进程的敏感指标。

本研究结果表明，肾气丸可以通过提高衰老大鼠血清睾酮水平、增强睾丸组织抗氧化能力及降低其生精细胞的凋亡指数来提升睾丸功能，起到延缓性腺衰老的作用。

4 参考文献

1翠 萍.补肾与抗衰老-兼谈金匮肾气丸的抗衰老作用〔J〕.中国实用医药，2008；3(17)：144.

2闫润红，李 瑞.试论肾虚与衰老〔J〕.山西中医学院学报，2006；17(5)：8-9.

3Yin YZ,Hawkins KL,Dewolf WC,etal.Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice〔J〕.J Androl,1997；18(2):159.

4Vermeulen A，Kaufman JM.Ageing of the hypothalam opituitary testicular axis in men 〔J〕.Horm Res,1995；4(3):25-30.

5Henriksen K,Hakovirta H,Parvinen M.Testosterone inhibits and induces apoptosis in rat seminiferous tubules in a stage-specific manner:in situ quantification in squash preparations after administration of ethane dimethane sulfonate〔J〕.Endocrinology,1995；136(8):3285.

6Harman D.The free radical theory of aging:Effect of age on serum copper levels〔J〕.J Gerontol，1965；20：151.

7Lantos J,Teme S，Gobolos L,etal.Is peripheral blood a reliable indicator of acuteox idative stress following heart ischemia and reperfusion〔J〕. Med Sci Monit,2001；7(6):1166.