氢化珊瑚钙对衰老小鼠的抗氧化作用的影响

曹烨骏 殷文哲 及川胤昭 丛峰松

(上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240)

最近一些关于缺血再灌注的研究证实了氢气是一种良好的抗氧化剂〔1～3〕。脑缺血再灌注损伤是因为需氧细胞代谢过程中产生的超氧自由基具有毒害效应，可使神经细胞膜结构破坏，从而引起神经元凋亡和脑组织的损伤〔4，5〕。根据研究，氢分子能够显著减少氧化压力，从而抑制缺血再灌注引起的脑损伤。另有研究研究表明〔6～8〕，氢气对于小肠、心脏及肾脏缺血再灌注损伤均有明显的治疗作用。氧化珊瑚钙(CCH)是采用固态氢化技术生产的一种负氢离子(H-)粉末，遇水会缓慢释放出氢。日本的Taneaki Oikawa等人发现给小鼠喂食氢化珊瑚钙，可以增加小鼠大脑海马内源性抗氧化能力〔9〕。本研究通过小鼠饲养实验，应用D-半乳糖构建小鼠衰老模型，测定CCH对血清、脑组织和肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)以及Na+-K+-ATPase的影响，从而了解其抗氧化作用及其机制。

1 材料与方法

1.1动物 昆明小鼠18只，体重(20±2)g，6周龄，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(沪)2003-0002。

1.2实验条件 上海交通大学闵行校区药学院动物饲养间，室温(24±2)℃，湿度(70±5)%，分每笼8只饲养，饲料由上海仕林生物科技有限公司提供。

1.3实验试剂 CCH由日本HIC公司制造，上海全人生物科技有限公司提供；D-半乳糖(Sigma)；考马斯亮蓝R-250染色液，脱色液；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)；MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；T-AOC试剂盒(南京建成生物工程研究所)；GSH-PX试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Na+-K+-ATPase试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4方法

1.4.1分组、灌胃及造模 小鼠购入试养2 d后，将18只小鼠随机分为3组：对照组、模型组、CCH组，各6只。各组均采用灌胃途径投入。灌胃30 d，灌胃体积0.2 ml/d。对照组及模型组予生理盐水灌胃；CCH组将CCH以蒸馏水配成1 mg/ml溶液，混匀，给予灌胃(现配现用)。每天灌胃后1 h，模型组及CCH组将D-半乳糖以蒸馏水配成10 mg/ml溶液，腹腔注射0.2 ml，建立小鼠衰老模型〔10〕。

1.4.2取样及数据测定 灌胃30 d后对小鼠进行解剖。用摘眼球法取小鼠全血，放入5 ml离心管中，静置2 h后，然后放入高速离心机中25 000 r/min离心3 min，取上清，再重复一次此操作后，取上清得到血清，放入离心管中待用。另取小鼠的脑和肝脏，置于生理盐水中，洗净表面残留血液，放入冻存管中，在液氮中保存。SOD、MDA、T-AOC、GSH-PX、Na+-K+-ATPase的测定分别按照对应试剂盒说明书操作，蛋白质的测定用考马斯亮蓝法。

1.5统计学处理 采用SPSS11.0软件行方差分析及q检验。

2 结 果

2.1CCH对小鼠血清的影响 与对照组比较，注射D-半乳糖能够显著降低血清及SOD活性，显著提高血清MDA含量(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，CCH能够显著提高血清T-AOC、SOD活性及GSH-PX活性极显著降低血清MDA含量(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.2CCH对小鼠脑组织的影响 与对照组比较，注射D-半乳糖能够显著降低脑组织SOD活性及GSH-PX活性，显著提高脑组织MDA含量(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，CCH能够显著提高脑组织总抗氧化能力、Na+-K+-ATPase活性(P<0.05)及GSH-PX活性，显著降低脑组织MDA含量(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表1 实验小鼠血清SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性及T-AOC检测结果

2.3CCH对小鼠肝组织的影响 与对照组比较，注射D-半乳糖能够显著降低肝组织FAOC、SOD活性、GSH-PX活性及Na+-K+-ATPase活性(P<0.05)。与模型组比较，CCH能够显著提高肝组织FAOC、SOD活性及GSH-PX活性，显著降低肝组织MDA(P<0.01，P<0.05)。见表3。

表2 实验小鼠脑组织SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性、Na+-K+-ATPase活性及T-AOC检测结果

表3 实验小鼠肝组织SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性、Na+-K+-ATPase活性及T-AOC检测结果

3 讨 论

D-半乳糖衰老模型是一种利用连续注射D-半乳糖，造成动物糖代谢紊乱的衰老模型。用D-半乳糖注射小鼠后，会出现多项生化指标的变化，包括SOD、GSH-PX活性及总抗氧化能力的降低和MDA含量的上升，这与衰老造成的变化是相一致的，证明其实一种可靠的衰老模型〔10，11〕。

人体中氧自由基的产生是不可避免的，当氧自由基不断增殖至清除不掉时就会损害机体，导致衰老。因此机体内形成了一套抗氧化防御体系，包括内源性抗氧化剂和抗氧化酶〔12〕。SOD是内源性超氧阴离子自由基清除剂，其活性高低可部分反映机体清除自由基的能力〔13〕。GSH-PX是生物体内广泛存在的一类重要的催化过氧化氢分解的酶。GSH-PX可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，阻止了H2O2源的OH·自由基的产生以及其触发的膜质的过氧化〔14，15〕。而T-AOC代表体内酶性和非酶性抗氧化物的总体水平，可以反应机体的健康状况，当一个人的总抗氧化能力降低时，易引起炎症、免疫系统疾病〔16〕。 MDA含量的增加会使膜流动性降低，通透性增加，大量Ca2+激活一系列的蛋白水解酶，引起迟发性细胞死亡〔17〕。另外，当细胞内Na+-K+-ATPase活性降低，会导致大量Na+进入细胞内，使得钠钙离子交换出现反转，胞内Ca2+超载，引起细胞死亡〔18〕。

CCH负氢离子(H-)粉末,是一种强还原剂，根据实验结果我们可以推测其抗衰老机制可能有以下两种机制：①负氢离子通过将自身携带的两个电子转移给活性氧自由基，直接清除活性氧自由基；②通过体内代谢途径，负氢离子、氢气或两者共同作用激活机体的GSH-PX和SOD等多种内源性抗氧化酶，使其活性提高，促进氧自由基被还原。

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