S1通过线粒体途径诱导人卵巢癌细胞凋亡

周翔宇 刘 宁 闫 珊 张志超 孙连坤

(吉林大学白求恩医学院病理生理学系，吉林 长春 130021)

目前卵巢癌是威胁女性健康的一个重要问题，化疗成为主要的治疗手段〔1〕。然而，化疗药物特异性差，其药物的损害作用也会攻击周围的正常组织，健康器官进一步被损害，从而带来更大的损伤。研究发现S1能诱导肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞凋亡〔2，3〕，本实验组之前的研究发现S1能有抑制卵巢癌细胞生存〔4〕，因此本实验进一步探讨S1诱导人卵巢癌细胞(SKOV3)细胞死亡机制，检测S1对细胞线粒体凋亡途径的影响，为S1进入临床治疗卵巢癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试剂与细胞 S1 由大连理工大学精细化工国家重点实验室设计并提供；十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基二乙胺(TEMED)、丙烯酰胺、N,N-二甲基双丙烯酰胺、吐温-20和叠氮钠物购自北京鼎国生物技术有限公司；胎牛血清、IMDM培养基购美国HyClone公司；胰酶购自美国Thermo公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)和细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所；Bcl-2、Bax、细胞色素(Cyto)C抗体购自美国Santa Cruz公司；β-actin购自EPITOMICS公司；二抗购自美国Pierce公司。SKOV3细胞系由吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室提供。

1.2细胞培养 SKOV3细胞培养在37℃、5%CO2孵箱中培养，用含10%胎牛血清的IMDM培养基常规方法培养，0.25%胰酶消化传代，取处于对数生长期细胞分组进行实验。

1.3JC-1检测线粒体膜电势 收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1～2次，加入500 μl JC-1染色液，37℃细胞培养箱中孵育20 min；3 000 r/min，4℃ 离心5 min，弃上清；加入1 ml预冷的JC-1缓冲液(1×)洗涤2次；加入200～300 μl JC-1缓冲液(1×)混匀；用流式细胞仪检测分析。

1.4Western 印迹 离心收集细胞，PBS 洗涤2次；加入细胞裂解液并提取蛋白，测浓度后取60 μg蛋白进行SDS-聚丙烯凝胶(PAGE)电泳；采用BIO-RAD转移装置将蛋白移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；转膜结束后将PVDF膜放入5% 的脱脂奶粉中1～2 h，封闭膜上的非特异结合位点；加入相应的一抗，4℃冰箱中过夜。次日PBS洗膜3次；加入1∶1 000稀释二抗室温孵育1.5 h；PBS洗膜3次；二氨基联苯胺(DAB)显色，凝胶成像系统采集图像后保存。

2 结 果

2.1JC-1染色检测线粒体膜电势 Bcl-2蛋白家族是S1诱导线粒体途径凋亡的关键分子，一旦表达失衡，会导致线粒体膜通透性改变，线粒体膜电势(ΔΨ)降低。根据文献报道〔4〕，选取5、10 μmol/L S1作用SKOV3细胞8 h，JC-1染色，流式细胞仪检测细胞荧光强度。S1作用SKOV3细胞荧光强度明显降低，表明线粒体膜电势(ΔΨ)明显降低(P<0.05，n=3)。

2.2Western 印迹方法检测S1对SKOV3细胞Cyto C蛋白表达的影响 当细胞受到内源性凋亡刺激时，线粒体膜孔道开放，电势下降，致使线粒体内Cyto C释放入胞质，胞质中Cyto C的含量明显增加。与对照组相比，S1作用SKOV3细胞8 h，胞浆Cyto C蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，n=3)。见图1。

图1 S1对人卵巢癌细胞胞浆Cyto C蛋白表达影响

2.3S1影响线粒体凋亡相关蛋白的活化 Bcl-2和Bax都是线粒体凋亡途径的标志性蛋白，当细胞受到内源性凋亡刺激时，抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax活化，进而激活下游caspase。5、10 μmol/L S1作用SKOV3细胞8 h，Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达增加，Bax/ Bcl-2表达显著升高(P<0.05，n=3)。见图2。

图2 S1对人卵巢癌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达影响

3 讨 论

细胞死亡是生命组成最基本的部分，在同一个组织中，多种细胞死亡方式可能都会被诱导，但凋亡的诱导往往是最快的〔5〕。凋亡也被称为程序性细胞死亡(PCD)，是通过内源性和外源性两条途径，外源性凋亡的发生主要是通过细胞表面死亡受体诱导，而内源性凋亡主要通过打击线粒体膜的稳定性〔6，7〕。通过结构和功能研究发现，在内源性凋亡过程中，主要是Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白之间的蛋白相互作用，从而控制线粒体的完整性〔8，9〕。大量的研究表明线粒体与细胞凋亡密切相关，其中线粒体跨膜电位的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

细胞凋亡调控是多基因参与的复杂网络系统，Bcl-2蛋白是重要的凋亡抑制基因。有研究表明，在抗凋亡蛋白Bcl-2过表达的细胞内，当化疗药物作用的时候，会促使Apaf-1、Cyto C和caspase形成聚集体(Apoptosome)，这个聚集体会阻止Cyto C的释放，以及抑制caspase的活化和级联反应。近年来的研究发现Bcl-2在肿瘤中的高表达可以使肿瘤细胞耐药性增高。因此，特异性的靶向作用Bcl-2抗凋亡蛋白，已经成为治疗肿瘤的新方法〔10〕。目前对于Bcl-2蛋白家族抑制剂的研究越来越多，并且合成了很多作用靶点不同的Bcl-2抑制剂，包括HA14-1、GX15-070、BI-33、ABT 737等。实际上，应用我国自行研制小分子BH3-only蛋白模拟物S1，与抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1蛋白均具有高度的亲和性，是Bcl-2和Mcl-1的双重抑制剂〔2～4〕。本研究结果提示S1通过破坏线粒体膜电势，迫使线粒体内大量Cyto C释放入胞浆诱导SKOV3细胞发生凋亡。既往的研究表明，在正常状态下，Bcl-2通过与Bax结合抑制Bax蛋白活性，进而抑制细胞凋亡。当BH3-only蛋白通过其BH3区域与Bcl-2结合，释放的Bax在线粒体外膜形成寡聚体孔道，因而可以破坏线粒体膜电势〔8，9〕。本研究结果提示S1可能是通过抑制Bcl-2蛋白，使得Bax蛋白活性增加，从而介导线粒体膜电势的改变，释放Cyto C，触发线粒体途径凋亡。

目前对于S1治疗卵巢癌的研究仅限于体外实验研究，还需进一步进行体内实验研究，为靶向Bcl-2抗肿瘤药物S1治疗卵巢癌提供了实验与理论依据。

4 参考文献

1Duncan R.Polymer conjugates as anticancer nanomedicines〔J〕.Nat Rev Cancer，2006；6(9)：688-701.

2Zhang Z,Wu G,Xie F,etal.3-Thiomorpholin-8-oxo-8H- acenaphtho〔1,2-b〕pyrrole-9-carbonitrile (S1) based molecules as potent,dual Inhibitors of B-Cell lymphoma 2 (Bcl-2) and myeloid cell leukemia sequence 1(Mcl-1):structure-based design and structure-activity relationship studies〔J〕.J Med Chem,2011；54(4)：1101-5.

3Zhang Z，Wu G，Gao J,etal.Inclusion complex of a Bcl-2 inhibitor with cyclodextrin：characterization，cellular accumulation，and in vivo antitumor activity〔J〕.Mol Pharm，2010；7(4)：1348-54.

4琴瀚姣，刘 宁，张 晶，等.Bcl-2抑制剂S1 诱导人卵巢癌细胞凋亡及其机制的研究〔J〕.吉林医学，2012；33(13)：2693-5.

5Los M，Mozoluk M，Ferrari D,etal.Activation and caspase-mediated inhibition of PARP：a molecular switch between fibroblast necrosis and apoptosis in death receptor signaling〔J〕.Mol Biol Cell，2002；13(3):978-88.

5Chaabane W,User SD,El-Gazzah M,etal.Autophagy,apoptosis,mitoptosis and necrosis:interdependence between those pathways and effects on cancer〔J〕.Arch Immuonl Ther Exp(Warss)，2013；61(1)：43-58.

6Ouyang L，Shi Z，Zhao S，etal.Programmed cell death pathways in cancer：a review of apoptosis，autophagy and programmed necrosis〔J〕.Cell Prolif，2012；45(6)：487-98.

7刘光伟，龚守良.细胞凋亡信号传导途径的研究进展〔J〕.吉林大学学报：医学版，2004；30(3)：485-8.

8Llambi F,Green DR.Apoptosis and oncogenesis：give and take in the BCL-2 family〔J〕.Curr Opin Genet Dev，2011；21(1)：12-20.

9Adams JM，Cory S.The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy〔J〕.Oncogene，2007；26(9):1324-37.

10Vogler M，Dinsdale D，Dyer MJ,etal.Bcl-2 inhibitors：small molecules with a big impact on cancer therapy〔J〕.Cell Death Differ，2009；16(3):360-7.