MACC1基因沉默对肺癌细胞促血管生成的影响

袁 兵 汤 琦 张云辉 许建彪 廖 凤 谭 燕 黄云超

(昆明医科大学第三附属医院，云南 昆明 650118)

目前肺癌的死亡率居各种恶性肿瘤之首〔1〕，由于大多数患者诊断时肿瘤出现远处转移，血管生成是实体肿瘤生长和侵袭转移的必要条件，研究肺癌血管生成对肺癌的防治尤为重要。而结肠癌转移相关基因(MACC1)是新近发现的一个与结肠癌转移密切相关的基因，MACC1基因的表达改变不仅在肠癌，而且可能包括肺癌在内的多种肿瘤的发生、侵袭和转移相关〔2～6〕，MACC1作为肝细胞生长因子(HGF) /c-met信号通路中的重要调节因子，能够上调c-met的表达〔2〕，既往研究显示c-met能够调节MAPK、STAT和PI3k-Akt等多条下游信号通路，这些通路是细胞核内主要调节通道，与肿瘤细胞增殖、运动、浸润、转移及血管生成等有关，说明MACC1可能在肺癌肿瘤血管生成起重要作用，但目前尚未见相关研究报道。本文拟通过筛选MACC1表达较高的肺癌细胞株，化学合成MACC1基因特异性siRNA转染该细胞，下调MACC1基因表达，观察MACC1基因对肺癌细胞促进血管形成能力的影响，为研究MACC1基因在肺癌血管生成中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 A549，XWLC-05，GLC，SPC-A-1，YTMLC细胞由云南省肿瘤医院肿瘤研究所提供，1640培养基、胰酶/乙二胺回乙酸(EDTA)消化液、无血清Opti-MEM培养基、胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM 2000，Trizol总RNA提取试剂均购自Invitrogen公司。Quant cDNA第一链合成试剂盒购自北京天根生化公司，MACC1及内参上下游引物由苏州金唯智生物公司合成，MACC1-siRNA 1～3及无义siRNA由广州锐博生物有限公司合成，Platinum®SYBR®Green qPCR试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1肺腺癌细胞的培养及传代 复苏A549，XWLC-05，GLC，SPC-A-1，YTMLC细胞株，加入含10% FBS的1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d进行常规换液传代。

1.2.2RT-qPCR 法检测细胞MACC1 mRNA的表达 采用Trizol 一步法提取各株细胞总RNA。取2 μg总RNA，参考逆转录反应试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。将逆转录合成的cDNA依照Platinum®SYBR®Green qPCR试剂盒说明书，行荧光定量PCR反应。MACC1(481 bp)正义：5′-TCGGTCAGGAAGAATTGC-3′。反义：5′-CTCTAAGTCGTGTAGTAGGAT-3′，β-actin(564 bp)正义：5′-CTGGGACGACATGGAGAAA-3′，反义：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。反应总体系25 μl，其中2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution为12.5 μl，10 μmol/L正义各0.5 μl，模板为1 μl，超纯水为10.5 μl。反应程序为：95℃预变性2 min，之后每一步95℃变性15 s；59.5℃退火30 s；72℃延伸30 s共35个循环。溶解曲线阶段：95℃变性15 s；60℃退火 30 s；72℃延伸30 s。所有样本均重复3次实验，最后由随机附带软件LCS480 1.5.039计算Ct值和拷贝数，2-△△CT分析法进行数值相对定量分析。

1.2.3MACC1 siRNA的设计合成 根据siRNA的设计原则，针对人MACC1 cDNA (序列编号: NM2003467)的编码序列。设计3条不同的siRNA序列及1条阴性对照siRNA序列：siRNA-1：AAAGACAGAAGGAGAAAGGdTdT；siRNA-2：AATCAACTGTCTGCTTCTAdTdT；siRNA-3：AATTATATGCCAGGACAGCdTdT；NT-siRNA：AACAGTTATCTATGCGACAdTdT。

1.2.4细胞转染及干扰效率的检测 选择MACC1 mRNA表达量最高的细胞进行后续实验，采用含100 ml/LFBS的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。调整细胞浓度，接种无菌6孔板，每孔约1×105个细胞。待其生长至80%融合时，按照LipofectamineTM 2000脂质体转染试剂盒说明书进行转染操作。转染前24 h将6孔板每孔加入Opti-MEM培养液2 ml。然后每孔加入siRNA-Lipofectamine 2000混合液500 μl，轻轻混匀，置于在37℃、5%的CO2培养箱中培养。6 h后更换成含血清的正常培养基继续培养，分别于24、48、72 h收集细胞进行后续实验。细胞分为空白对照组、无义siRNA转染组和MACC1-siRNA 1～3转染组。siRNA浓度为50～100 nmol/L为初步预实验条件。

采用半定量RT-PCR方法于转染后24 h时进行沉默效率的检测。总RNA提取和cDNA的合成采用之前的方法。MACC1和β-actin的引物同前。采用天根公司PCR-MasterMix对各转染组进行半定量PCR。相同含量的PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。采用Bio-rad公司的Quantity One软件进行分析。β-actin作为归一化内参。半定量RT-PCR检测实验重复3次。

1.2.5鸡胚尿囊膜(CAM)检测血管生成情况 72 h后收集各实验组细胞上清液，选择表面清洁、蛋壳均质、重量50～65 g、外形规范、气室、气孔均匀的种蛋为受试对象。孵育前用温水(40℃～50℃)清洗2遍，以1∶1 000新洁尔灭溶液浸洗擦干。将种蛋置于(38.0±0.5)℃、相对湿度65%～70%的培养箱中孵化，在孵化过程中翻蛋2次/d，以防止胚胎发生粘连，并且促进鸡羊膜运动， 每日用透射灯检查胚胎发育情况，第3天无血管出现者淘汰出实验，鸡胚孵化第7天，在透射灯下观察并确定CAM，将鸡胚随机分成三组，每组8只，用微量加样器分别在CAM表面离开尿囊膜血管的空白处加100 μl的空白对照组上清液，100 μl MACC1-siRNA3组细胞培养上清液，100 μl无义siRNA组细胞培养上清液。继续孵育48 h，暴露加药区尿囊膜，滴入固定液(甲醇和丙酮1∶1)固定15 min，待CAM上的血管凝固后，剥离假气室周围的蛋壳，使CAM充分暴露，以载体为中心用眼科剪剪下约3 cm×3 cm的尿囊膜，平铺于平皿中展开，晾干，置于显微镜下观察。取出CAM放在滤纸上，并以滤纸为背景，在自然光线下用数码相机采用近距离模式原位于光学显微镜相同物镜倍数(×10)下观察血管分支并摄片，参考文献〔7〕中的分析方法对血管面积进行测定，计算面积比。

1.3统计学分析 采用SPSS16.0软件进行分析，各肺癌细胞株中MACC1 mRNA的表达量与XWLC-05细胞之间的比较，不同MACC1-siRNA与无义siRNA组和对照组之间的比较，MACC1-siRNA实验组CAM与无义siRNA组和对照组CAM之间的比较均应用单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1RT-qPCR检测各株细胞中MACC1 mRNA的表达情况 实时荧光定量PCR结果显示，各株细胞中，XWLC-05细胞中MACC1的mRNA表达水平最高，SPC-A1肺腺癌细胞没有检测到MACC1 mRNA表达，提示其表达MACC1 mRNA的水平极低，其余各个细胞中MACC1 mRNA的表达量依次为A549>GLC>YTMLC。见表1。

2.2siRNA对XWLC-05细胞MACC1 mRNA 表达的影响 半定量RT-PCR结果显示，各组可见亮度较均一的β-actin条带，空白对照组及无义siRNA转染组可见明显的MACC1目的条带，与空白对照组相比，转染MACC1-siRNA1的XWLC005细胞中MACC1 mRNA的表达变化不太明显，而MACC1-siRNA2和MACC1-siRNA3转染组中的MACC1 mRNA表达水平明显降低，其中MACC1-siRNA3的抑制率最高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。因此选用该siRNA进行后续实验。见图2。

表1 各肺癌细胞株中MACC1mRNA的表达量

1～6:siRNA1,siRNA2,SiRNA3,NT-siRNA,Cont,Marker

2.3MACC1-siRNA对CAM血管生成的影响 三组细胞上清液对鸡胚的存活率没有显著影响。形态学上观察，无义siRNA组及空白对照组可见稍多的血管分支，而MACC1-siRNA组则多见长且粗的大血管，血管分支较少。MACC1-siRNA3组血管面积〔(5.82±0.74)%〕较无义siRNA组〔(9.54±1.11)%〕及空白对照组〔(10.03±0.49)%〕减少(P<0.05)；而无义siRNA组及空白对照组组间比较差异无显著性(P>0.05)。见图2。

对照组 无义siRNA组 MACCl-siRNA组

3 讨 论

本研究结果说明了MACC1基因对肺癌细胞促进血管形成能力的影响，为进一步研究肺癌血管生成机制奠定了一定的实验基础。

肿瘤异质性理论认为，肿瘤是一个由具有不同遗传背景的细胞亚群组成的异质性群体，在一个原发肿瘤细胞群中，并不是所有瘤细胞具有侵袭和转移能力，这说明不同肺癌细胞之间具有不同的肿瘤异质性，而这种肿瘤异质性如迁移、黏附等生物学行为与不同肺癌细胞某些基因的突变有关。本实验荧光定量PCR检测显示各肺癌细胞株细胞中MACC1 mRNA的表达不一致，在所检测的五株肺癌细胞株中MACC1 mRNA的表达量依次为XWLC-05>A549>GLC>YTMLC> SPC-A1，MACC1在不同肺癌细胞中表达的差异性，可能是不同肺癌细胞具有不同的恶性生物学特性，如侵袭和转移的原因之一。

Arlt等〔8〕发现MACCl表达水平上调者术后发生转移或复发明显增加。进一步研究显示MACC1在良性向恶性转化组织中的表达逐渐升高，原发或转移性肿瘤中MACC1表达水平明显增高，尤其在发生远端转移患者，其表达水平能反映原发肿瘤远处转移能力〔2,8〕。而肿瘤血管形成能为肿瘤细胞的播散提供最直接的通道，是肿瘤细胞迁移游走形成转移的关键环节，本研究说明干扰MACC1后肿瘤细胞诱导微血管生成潜能明显减弱，提示MACC1与宣威肺腺癌细胞株XWLC-05诱导微血管形成相关。

血管形成是促血管生成因子与抑制因子互相作用的结果，先前文献报道肿瘤细胞本身可以合成分泌促血管生成因子包括多种生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)家族、成纤维细胞生长因子(FGF)家族、血管生成素家族以及血管生成相关性趋化因子和细胞因子如白细胞介素(IL-8)等，诱导血管生成。而这些促血管生成因子的分泌受HGF/c-MET调节，作为HGF/c-MET信号通路的关键调节因子MACC1能有效降低宣威肺腺癌细胞XWLC-05诱导CAM微血管形成的能力，其具体调控机制如何需要进一步研究。

4 参考文献

1Lopes-Pegna A,Picozzi G,Falaschi F,etal.Four-year results of low-dose CT screening and module managment in the ITALUNG trial〔J〕.J Thorac Oncol,2013;8(7):866-75.

2Stein U,Walther W,Arlt F,etal.MACC1,a newly identified key regulator of HGF-MET signaling,predicts colon cancer metastasis〔J〕. Nat Med,2009;15(1):59-67.

3Stein U,Dahlmann M,Walther W. MACC1 - more than metastasis? Facts and predictions about a novel gene〔J〕. J Mol Med (Berl),2010;88(1):11-8.

4Shimokawa H,Uramoto H,Onitsuka T,etal.Overexpression of MACC1 mRNA in lung adenocarcinoma is associated with postoperative recurrence〔J〕. J Thorac Cardiovasc Surg,2011;141(4):895-8.

5Shirahata A,Fan W,Sakuraba K,etal.MACC 1 as a marker for vascular invasive hepatocellular carcinoma〔J〕. Anticancer Res,2011;31(3):777-80.

6Chundong G,Uramoto H,Onitsuka T,etal.Molecular diagnosis of MACC1 status in lung adenocarcinoma by immunohistochemical analysis〔J〕.Anticancer Res,2011;31(4):1141-5.

7许 扬,赵英凯,毕明刚,等.Image-Pro Plus图像分析软件定量鸡胚尿囊膜血管新生面积的方法〔J〕.中国比较医学杂志,2007;17(12):745-7,封3.

8Arlt F,Stein U. Colon cancer metastasis: MACC1 and Met as metastatic pacemakers〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2009;41(12):2356-9.