食管鳞癌中MDR1基因的表达与多药耐药的关系

刘 亮 左连富 郭建文

(河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室，河北 石家庄 050011)

目前认为肿瘤多药耐药产生与一类跨膜蛋白的产生有关，这类跨膜蛋白多为三磷酸腺苷结合转运蛋白(ABC)〔1，2〕，研究较多的为ABCB1，又称多药耐药1(MDR1)蛋白，由MDR1基因编码。本研究检测食管癌组织中MDR1基因表达水平，从而探讨食管癌多药耐药产生与MDR1基因表达的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料 收集河北医科大学第四医院2008年1月至2009年11月食管鳞状细胞癌手术切除标本150例，所有患者术前未接受过化疗和放疗。每例标本分别取癌组织、癌旁组织(距癌边缘2～5 cm)及手术切缘正常食管黏膜(距癌边缘5 cm以上)。术中立刻取新鲜食管癌组织、同个体癌旁食管组织及手术切缘正常食管组织，保存在液氮中。所有标本临床病理资料完整，全部经病理检查确诊。从中选出80例食管鳞状细胞癌、不典型增生和正常食管黏膜组织，用于RT-PCR的检测，食管鳞状细胞癌80例患者中男性55例，女性25例，年龄38～83岁，平均年龄(58.38±6.70)岁，中位年龄58.5岁。

1.2细胞株来源 人食管癌细胞株Eca109细胞本实验室传代培养。食管癌耐药细胞株Eca109/ADM本实验建立培养〔3〕。

1.3主要实验仪器及试剂 PCR自动扩增仪，德国Eppendorf公司；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman-Coulter公司；MDR1及GAPDH引物，上海生工生物工程公司。MDR1 抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司；羊抗鼠FITC二抗(Lot:74628)，美国Jackson ImmunoResearch。

1.4RT-PCR方法检测细胞中MDR1 mRNA表达水平 取生长状态良好处于对数生长期的 Eca109、Eca109/ADM 细胞，或不同病变的食管组织，冷 PBS 洗涤 2 次，加入1 ml Trizol 试剂，常规一步法提取总RNA。RT-PCR 方法采用两步法，MDR1上游引物5′-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3′，下游引物5′-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3′，扩增片段167 bp。GAPDH 上游引物5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，扩增片段452 bp。扩增条件为94℃5 min， 94℃30 s，58℃30 s， 72℃30 s，共 30 个循环， 72℃10 min。对扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，溴乙啶染色，在凝胶成像分析仪下成像，用 Gel-proAnalyzer3.1 软件分析扩增产物的光密度(OD) 值，计算MDR1 OD 值/GAPDH OD 值的比值，对MDR1mRNA表达强度进行光密度半定量分析。

1.5流式细胞术检测细胞中MDR1蛋白的表达 取生长状态良好，处于对数生长期的Eca109和Eca109/ADM细胞，冷PBS洗涤2次，用0.25%胰酶消化，4℃预冷的PBS缓冲液洗2遍细胞后，离心弃去上清液，冷磷酸缓冲液(PBS)将沉淀细胞重悬浮1×106个/100 μl，取单细胞悬液100 μl (含1×106个细胞)，加入1∶100稀释的小鼠抗人MDR1抗体100 μl，室温放置30 min，PBS洗涤细胞一次，弃上清，加入羊抗小鼠IgG-FITC二抗工作液100 μl，避光室温放置30 min，PBS洗涤细胞1次，弃上清，上机检测前加入PBS1.0 ml，经300目尼龙网过滤后上机检测。在对免疫荧光标记物测定时，分别设PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的同型对照。FCM检测细胞MDR1蛋白的表达量以平均荧光强度表示，实验重复3次。

1.6荧光免疫细胞化学方法检测细胞中MDR1蛋白表达及定位 将洁净、消毒盖玻片置于6孔板内，用0.25%胰蛋白酶消化单层培养肿瘤细胞(Eca109、Eca109/ADM)，调整细胞浓度将细胞按5×104/孔接种于6孔板，进行细胞爬片，将六孔板放置37℃、5% CO2的培养箱内常规培养，培养24 h待细胞贴壁后，弃去培养液，用4%多聚甲醛固定15 min，用PBS洗涤5 min×3次，0.1% TritonX-100作用10 min，PBS洗涤5 min×3次，滴加正常山羊血清10 μl湿盒封闭30 min，倾去血清，滴加小鼠抗人MDR1抗体，室温放置1 h，PBS洗涤5 min×3次，滴加羊抗小鼠IgG-FITC二抗，室温避光放置1 h，PBS洗涤5 min×3次，激光共聚焦荧光镜观察细胞内MDR1蛋白荧光表达。

2 结 果

2.1不同食管病变组织中MDR1 mRNA表达水平 MDR1 mRNA在食管正常组织、不典型增生及癌组织表达水平分别为0.56±0.14、0.61±0.16、0.70±0.15，MDR1 mRNA在食管癌中的表达水平显著高于正常及不典型增生组织(P<0.05)(图1)。MDR1 mRNA在食管不典型增生Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中的表达水平分别为0.55±0.20、0.58±0.11、0.68±0.17，不典型增生Ⅲ级中的表达水平显著高于不典型增生Ⅰ级(P<0.01)。

M：DNA标准分子；A：正常组织；B：不典型增生；C：食管鳞癌

2.2食管癌组织中MDR1 mRNA表达与临床病理特征的关系 食管癌组织中MDR1 mRNA表达水平，低分化者、浸润深度达到纤维膜者、有淋巴结转移者显著高于中高分化者、浸润深度未达到纤维膜者、无淋巴结转移者(P<0.05)。年龄和性别之间表达量无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 食管鳞癌组织中MDR1 mRNA表达与临床病理特征之间的关系±s)

2.3食管癌耐药细胞Eca109/ADM中 MDR1 mRNA及蛋白表达 Eca109/ADM细胞中MDR1 mRNA及蛋白表达水平分别为0.71±0.05、525.68±16.56，与Eca109细胞中表达水平(0.50±0.06、472.85±11.34)相比显著增高(P<0.05)。激光共聚焦荧光显微镜检测结果显示，MDR1蛋白主要表达在细胞膜及胞质，Eca109/ADM细胞中MDR1蛋白表达水平显著高于Eca109细胞中的表达(图2)。

图2 激光共聚焦显微镜检测细胞中MDR1蛋白表达

3 讨 论

食管癌是我国较常见的恶性肿瘤，尤其在河北的磁县和河南的林县食管癌的发病率较高，严重影响了人们的生命健康，食管癌化疗效果不佳，主要原因可能是由于多药耐药的产生。目前食管癌多药耐药发生的机制仍未阐明。研究发现，多药耐药的发生与一类跨膜蛋白的表达有关，这类跨膜蛋白多为ABC〔4，5〕，研究较多的为ABCB1及ABCG2(又称BCRP)〔6～9〕。已有较多的研究报道MDR1及BCRP参与多种肿瘤的多药耐药的产生，但在食管癌中的研究较少。本课题在以往研究中发现，BCRP参与食管癌多药耐药的发生〔10，11〕。

实验中利用RT-PCR的方法检测了不同食管病变组织中MDR1 mRNA表达水平，结果显示食管癌中MDR1 mRNA表达水平显著高于不典型增生及正常组织，且在不典型增生Ⅰ级至Ⅲ级之间呈现逐渐增高趋势，高表达MDR1的食管癌细胞可以外排化疗药物，降低细胞内化疗药物的有效浓度，从而逃逸化疗药物的杀伤，存活下来，参与食管癌多药耐药的形成。逃逸化疗药物杀伤的多药耐药细胞也可能成为食管癌复发的因素。MDR1在食管癌中的高表达可能参与了食管癌多药耐药的产生，检测食管癌中MDR1表达水平可为食管癌患者化疗方案的制定提供依据。

为进一步研究MDR1与食管癌多药耐药的关系，实验中利用多种实验方法检测了食管癌多药耐药细胞中MDR1基因及蛋白的表达水平，结果提示，MDR1的高表达可能参与了食管癌多药耐药的发生。

综合，MDR1的高表达与食管癌多药耐药的发生有关，为食管癌多药耐药逆转的靶向研究提供作用靶点，为进一步阐明食管癌多药耐药机制提供实验基础。

4 参考文献

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