载黄芪多糖组织工程支架促糖尿病大鼠皮肤创伤修复研究

王 飞，刘国夫，陈 蒙，左 建，杨 晔

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

载黄芪多糖组织工程支架促糖尿病大鼠皮肤创伤修复研究

王 飞，刘国夫，陈 蒙，左 建，杨 晔

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

目的研究载黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)组织工程支架(APS/PDLGA)对糖尿病大鼠皮肤创面愈合的影响。方法采用高压静电纺丝技术制备APS/PDLGA超细纤维，构成三维纤维网状组织工程支架；扫描电子显微镜观察纤维形貌，并计算直径；采用苯酚-浓硫酸法检测载药量与包封率；将APS/PDLGA用于糖尿病大鼠皮肤溃疡创面修复，采用苏木精-伊红染色观察各实验组皮肤修复进程。结果APS/PDLGA纤维表面光滑、粗细均匀、直径(2.56±0.50)μm、载药量(5.22±0.076)%、包封率(90.06±1.31)%，覆盖APS/PDLGA纤维膜组的糖尿病大鼠皮肤创面约在第18天完全愈合，新生上皮外观与结构和正常皮肤相似，愈合速度明显快于空白PDLGA纤维膜组和对照组创面(P<0.01)。结论APS/PDLGA纤维组织工程支架可促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合，有望应用于糖尿病皮肤溃疡治疗。

高压静电纺丝；载黄芪多糖组织工程支架；糖尿病大鼠；皮肤创面愈合

糖尿病难愈性溃疡是由糖尿病微血管病变与神经病变所引起的常见糖尿病并发症之一。据WHO最新统计,中国糖尿病患者已达9 240万，约超过15%的糖尿病患者发生足溃疡，80%的糖尿病患者会因足溃疡而导致截肢，给患者带来巨大的伤害[1-3]。自体皮肤移植在糖尿病皮肤溃疡的治疗中取得了很大的成功，但是新增手术创伤以及自体皮肤来源不足限制了其在临床上的应用[4]。随着组织工程技术的发展，研发治疗糖尿病皮肤溃疡的组织工程支架成为关注焦点。近年发展起来的高压静电纺丝技术可用于聚合纳米纤维的制备，它不但能够直接利用多种天然或合成高分子材料，而且可以在制备过程中负载多种生物活性物质，获得的三维纤维网具有高比表面积、高孔隙率的特点，经大量实验证实可模拟细胞外基质结构，为细胞生长提供与机体类似的生长微环境[5-6]。借此优势，静电纺丝技术已经广泛地应用于组织工程领域中。

黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是中药黄芪的主要活性成分。研究发现，APS通过促进一氧化氮生成加快内皮细胞增殖、迁移与管腔生产，进而促进血管新生，对糖尿病血管并发症有明确的治疗作用[7]。本研究通过高压静电纺丝技术将APS负载于可降解聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(D,L-lactide-co-glycolide)，PDLGA)纤维中，构建载APS的三维纤维网状组织工程支架APS/PDLGA，并考察其对糖尿病大鼠皮肤创伤的修复作用。

1 材料

1.1 主要药品与试剂 黄芪多糖(纯度：80.6%)：本实验室自行提取[8]；PDLGA(62 kDa)：浙江普洛家园生物医学材料有限公司，批号 Y10080911002；天狼星红、链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：美国Sigma公司，批号分别为2829438、18883664；苏木精染色液、伊红染液、中性树胶：广州市欣源贸易有限公司，批号分别为474077、C0109、20110930。

1.2 仪器与设备 DW-P303-1ACF0型高压直流电源：天津市东文高压电源厂；LSP01-1A型微量注射泵：保定兰格恒流有限公司；DZF-200型真空干燥箱：上海浦东跃新科学仪器厂；DF-101B型恒温磁力搅拌器：河南省巩义市英峪予华仪器厂；UV757CRT型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器厂；Quanta200型扫描电子显微镜：日本生产；血糖测试仪：长沙三诺生物传感技术有限公司。

1.3 动物 SD大鼠，雄性，3月龄，体质量200～250 g。安徽医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(皖)2011-002。

2 方法

2.1 高压静电纺纤维制备 精密称取0.198 7 g PDLGA溶于2.00 mL二氯甲烷，配制质量分数为7%的PDLGA溶液。精密称取1.028 0 g APS粉末溶于5.00 mL蒸馏水，配制0.205 6 g/mL APS溶液，加入少量羧甲基纤维素钠作为乳化剂，精密移取60 μl，高速搅拌过程中缓慢滴加至PDLGA溶液中，搅拌30 min，得载药油包水乳液。将乳液倒入2 mL注射器中，采用削平的9号注射针头作为喷嘴，注射泵连接高压直流电源的正极，铝箔接收板连接其负极，在喷嘴与收集板间距离18 cm、电压15 kV、流速1.0 mL/h条件下接收载APS纤维APS/PDLGA。以相同实验参数制备不含APS油包水乳液，并以上述同样方法与实验参数制备并接收空白PDLGA纤维。以真空干燥箱去除纤维中残留溶剂，4 ℃干燥条件下保存。

2.2 纤维形貌表征 取少量空白PDLGA与APS/PDLGA纤维膜，固定于铜靶，喷金，扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观察纤维膜形貌并拍照，随机选取3张同一倍数下纤维图片，以Adobe Photoshop CS3软件分别测量每根纤维直径，计算平均值。

2.3 APS/PDLGA纤维载药量、包封率测定 称取APS粉末4.0 mg 溶于10.00 mL蒸馏水，配制浓度0.4 mg/mL APS溶液。精密移取此溶液0.00、0.02、0.04、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00 mL，加蒸馏水补足至2.00 mL，加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸4 mL，水浴加热15 min，于紫外可见分光光度计490 nm处测定吸光度值，绘制APS浓度测定标准曲线。

称取15 mg APS/PDLGA纤维膜，加入0.50 mL二氯甲烷至完全溶解，以2.00 mL蒸馏水反复萃取APS 3～5次，静置，取上清液，以上述苯酚-浓硫酸法测定纤维中APS含量，根据下列公式计算APS/PDLGA纤维载药量与包封率，实验平行进行3次。

载药量=(载药纤维膜中APS的质量/载药纤维膜的质量)×100%。

包封率=(载药纤维膜中APS的质量/APS投药量)×100%。

2.4 APS/PDLGA纤维膜对糖尿病皮肤创伤的修复作用评价

2.4.1 糖尿病皮肤创伤模型复制：大鼠18只，随机平均分为6组，每组各3只，禁食12 h 后，以45 mg/kg浓度腹腔注射2% STZ柠檬酸钠缓冲液(pH值=4.0)，3 d后测定血糖浓度，如测定结果高于16.7 mmol/L则糖尿病模型复制成功，如低于16.7 mmol/L继续追加STZ。参考张臻等[9]糖尿病大鼠皮肤创伤模型的复制方法，以300 mg/kg剂量注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，8% Na2S褪去大鼠背部毛发，在背脊柱部去除3个直径约1.8 cm的圆形区域的全层皮肤。精密称取空白PDLGA与APS/PDLGA纤维膜各10.0 mg，分别覆盖于创面，以不做处理创面作为对照组。各组创面用纱布覆盖并以3号线固定纱布防止纤维膜脱落，为避免大鼠间相互舔舐伤口及抓挠纱布，手术后均单笼饲养。见图1。

注：A.大鼠去除背部全层皮肤模型图；B.创面缝合图

图1糖尿病大鼠皮肤创面模型

2.4.2 创面愈合观察：创面处理后，观察不同时间点(3、6、9、12、15、18 d)各组皮肤的愈合情况，对各组创面进行拍照，并计算各组创面在不同时间点愈合率[10]。

2.4.3 苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色：取糖尿病大鼠术后各时间点各实验组创面新生组织，冰冻切片，多聚甲醛固定后，作常规HE染色，显微镜下观察。

3 结果

3.1 纤维形貌表征 空白PDLGA纤维与APS/PDLGA纤维表面光滑，粗细均匀，无液滴、黏连及分叉现象，直径分别为(2.52±0.60)μm与(2.56±0.50)μm，两组纤维直径差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：A.空白PDLGA纤维；B.APS/PDLGA纤维。

图2空白PDLGA与APS/PDLGA纤维的SEM图片(5 000倍)

3.2 APS/PDLGA纤维载药量与包封率 APS/PDLGA纤维载药量为(5.22±0.076)%，与理论载药量相近；包封率为(90.06±1.31)%。李沉纹等[11]利用静电纺丝技术于不同参数下制备载药聚乙烯醇-海藻酸钠纳米纤维，药物包封率多在65%左右，而本研究中药物包封率远高于该报道，分析这是由于本研究将药物溶液分散于纤维基质材料聚合物溶液中形成稳定的油包水乳液，高压静电纺丝过程中药物损失较少。

3.3 创面愈合情况观察 糖尿病大鼠背部皮肤创面愈合率显示，术后第6、12与18天覆盖APS/PDLGA纤维膜组创面各个时间点的愈合率均显著高于其他各组(P<0.01)。术后第6天，可见多数实验组创面的纱布因伤口结痂收缩而自动掉落或被大鼠抓除，APS/PDLGA纤维膜组创面已有大面积愈合，创面中心处基底充血，大量肉芽组织增生，愈合处新生皮肤较薄，无感染情况；空白PDLGA纤维膜组创面结痂，愈合面积明显小于APS/PDLGA纤维膜组；对照组创面有明显的炎症现象，且未愈合面积较大。术后12 d，APS/PDLGA纤维膜组创面愈合面积达(92.42±1.85)%，仅中心处有小部分创面未愈合，新生皮肤有少许毛发生长；空白PDLGA纤维膜组和对照组未愈合面积超过1/4。术后18 d，APS/PDLGA纤维膜组创面已几乎完全愈合，新生皮肤表面光滑、色泽较好，毛发生长明显增多；空白PDLGA纤维膜组和对照组仍有约1/5创伤面积未愈合。说明覆盖于糖尿病大鼠皮肤创面的APS/PDLGA纤维膜，不但可以保护创伤部位免于感染，并可通过持续释放APS，对糖尿病大鼠皮肤创面与创周组织内皮细胞功能与结构的改善起到积极的作用，促进创面微血管重建，从而有效地促进伤口愈合。见图3。

图3 术后6、12、18 d糖尿病大鼠各组皮肤创面愈合情况(A. 愈合状况图；B. 创面愈合率;n=3)

3.4 HE染色结果 术后6 d，APS/PDLGA纤维膜组出现明显的修复迹象，创面被大量纤维细胞填充，有明显微血管形成，无聚合物纤维残留，有大量胶原分泌；空白PDLGA纤维膜组创面有修复现象，但胶原分泌量较少，组织结构松散，仍有零星未完全降解聚合物纤维存在；对照组创面无明显修复迹象，细胞数稀少，创面填充物多为炎性渗出物。术后18 d，APS/PDLGA纤维膜组创面新生皮肤真皮层由大量胶原纤维与少量的成纤维细胞填充，可观察到明显的处于分化阶段的皮肤附属器，表皮层结构与正常皮肤表皮结构相似；空白PDLGA纤维膜组新生皮肤组织中聚合物纤维完全降解，表皮和真皮层均仍处于修复过程，新生真皮层有大量胶原纤维分泌但结构松散，表皮层结构分化不完全；对照组创面新生皮肤真皮层仍有大量纤维细胞，仅有少量胶原纤维存在，表皮层较厚且分化不完全。HE染色结果说明，APS/PDLGA纤维膜在应用于糖尿病皮肤创面的修复过程中，一方面通过其三维纤维网状结构为细胞生长提供力学支撑，加速肉芽组织生成，另一方面通过不断释放具有促血管新生作用的APS，促进创周组织中血管内皮细胞的分裂、增殖、分化以及向创面迁移，并改善创周的血管功能，进而促进皮肤创面的愈合。见图4。

图4 各组糖尿病大鼠术后6、18 d创面新生组织(HE染色，10×20倍，红色箭头示新生微血管)

4 结论

皮肤组织工程产品是目前治疗皮肤缺损的研究热点。笔者针对糖尿病皮肤溃疡发生与不愈的病机，结合APS的药理作用，通过高压静电纺丝技术制备携载APS聚合物纤维，构成功能化三维纤维网状组织工程支架APS/PDLGA，尝试应用于糖尿病大鼠皮肤创伤的治疗。载APS聚合物纤维形貌良好，载药量及包封率与理论值接近；糖尿病大鼠皮肤创伤治疗的实验证明，APS/PDLGA纤维膜可以通过APS的持续释放与纤维膜的类细胞外基质结构，提高糖尿病大鼠皮肤创伤的愈合速度。本研究可为开拓糖尿病皮肤溃疡的治疗新技术提供理论与实验基础。

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PromotiveEffectofAstragalusPolysaccharides-LoadedTissueEngineeringScaffoldsonSkinWoundHealinginDiabeticRats

WANGFei,LIUGuo-fu,CHENMeng,ZUOJian,YANGYe

(DepartmentofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo study the effect of Astragalus polysaccharides (APS)-loaded tissue engineering scaffolds composed of poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PDLGA) on the skin wound healing in diabetic rats.MethodsElectrospinning was used to prepare APS/PDLGA ultrafine fibers and form a three-dimensional fibrous reticular tissue engineering scaffold. The morphology of APS-loaded PDLGA fibers was observed under a scanning electron microscope (SEM), and the diameter of each fiber was calculated. Drug loading rate and encapsulation efficiency were measured by phenol-sulphate colorimetry. The APS/PDLGA scaffolds were used to treat skin ulcer wounds in some diabetic rats; the other rats were treated with blank PDLGA fibrous membrane or not treated to allow natural healing. The skin wound healing was observed by hematoxylin and eosin staining.ResultsSEM images showed that the APS/PDLGA fibers were smooth and had a uniform thickness, with a diameter of (2.56±0.50)μm, a drug loading rate of (5.22±0.076)%, and an encapsulation efficiency of (90.06±1.31)%. The skin wounds of rats in the APS/PDLGA group completely healed approximately on day 18, and the newly formed skin had similar appearance and structure as the normal skin; wound healing was significantly faster in the APS/PDLGA group than in the blank PDLGA group and natural healing group (P<0.01).ConclusionAPS/PDLGA tissue engineering scaffolds can promote skin wound healing in diabetic rats and hold promise for application in treatment of diabetic skin healing.

electrospinning; Astragalus polysaccharides-loaded tissue engineering scaffold; diabetic rat; skin wound healing

安徽中医药大学科研创新项目(20120107)

王飞(1989-)，男，硕士研究生

杨晔，gnayye@126.com

R944

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.06.018

2014-03-09)