IL-17A在胃癌中的表达及其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响*

吴小琴 曾志荣 许丽霞 曹清华 陈 斌 陈旻湖 胡品津

广州医科大学附属第二医院消化科1(510260) 中山大学附属第一医院消化科2 病理科3

胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，严重威胁人类生命。炎症与癌症关系密切，被列为癌症的第七大特征[1]，而白细胞介素-17A(IL-17A)可能参与了炎症相关肿瘤的形成。本课题组前期研究[2]发现，IL-17A G197A多态性与某些亚型胃癌的发生风险增加有关。本研究通过分析IL-17A在胃癌组织中的表达，并探讨体外IL-17A处理对胃癌细胞增殖、凋亡及其下游肿瘤相关炎性因子表达的影响，以期进一步了解IL-17A与胃癌的关系。

材料与方法

一、标本获取

选取2004年7月～2005年6月于中山大学附属第一医院行胃癌根治术的54例胃癌患者的癌组织和16例相应癌旁非癌组织(距离癌灶边缘>3 cm)，所有标本均经HE染色病理检查明确诊断。入选患者男33例，女21例，年龄41～72岁，平均(56.7±12.6)岁。所有患者手术前均未接受过放、化疗。

二、细胞株、主要试剂

胃癌细胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16购自美国ATCC公司，传代培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI1640培养基中(37 ℃，5%CO2)；山羊抗人IL-17A多克隆抗体、重组人IL-17A蛋白购自美国R&D公司；细胞总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；RT-PCR和real-time PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司；MTT和Annexin V-FITC试剂盒购自广州展晨生物科技有限公司。

三、方法

1. 免疫组化法检测IL-17A表达：以免疫组化SP法检测胃癌组织和相应癌旁非癌组织中的IL-17A表达和分布。组织切片脱蜡、水化，3% H2O2室温封闭5～10 min，蒸馏水洗涤3次，置于10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液中加热20 min，PBS冲洗后加入山羊抗人IL-17A多克隆抗体(1∶400)，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗后加入二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染、脱水、中性树胶封固后于光学显微镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性切片作为阳性对照。IL-17A免疫组化染色阳性细胞胞质呈棕褐色。参考Zhang等[3]采用的方法，每例标本选取5个视野(×400)计数阳性细胞，结果取均值。

2. RT-PCR法检测IL-17A mRNA表达：取对数生长期胃癌细胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16，以炎症性肠病患者外周血单核细胞作为阳性对照，参照细胞总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒说明书进行操作。IL-17A引物上游：5’-ACT CCT GGG AAG ACC TCA TTG-3’，下游：5’-GGC CAC ATG GTG GAC AAT CG-3’；GAPDH 引物上游：5’-TGG TCT CCT CTG ACT TCA AC-3’，下游：5’-GTG AGG GTC TCT CTC TTC CT-3’。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共35个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳后，上UVP GDS-7600 凝胶图像成像系统检测。

3. 细胞增殖检测：取对数生长期SGC7901细胞制成单细胞悬液，以9×103/孔接种于96孔板，培养4～6 h后，分别加入不同浓度(10、50、100 ng/mL)重组人IL-17A，对照组加入等体积DMSO，培养24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h，终止培养，弃上清液，加入DMSO 200 μL，低速振荡10 min，以酶标仪测定492 nm波长处各孔吸光度(A)值。细胞增殖率=实验孔A值/对照孔A值×100%。实验重复3次，结果取均值。

4. 细胞凋亡检测：取对数生长期SGC7901细胞，以5×104/孔接种于6孔板，加入含0.25 mmol/L H2O2的无血清RPMI1640培养基培养2 h，PBS冲洗2次，换为含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，并加入不同浓度(0、10、100 ng/mL)重组人IL-17A，继续培养12 h，按Annexin V-FITC试剂盒说明书行细胞染色，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

5. real-time RT-PCR法检测IL-6、基质金属蛋白酶-13(MMP-13) mRNA表达：取对数生长期SGC7901细胞接种于6孔板，待细胞完全贴壁后，换为含不同浓度(0、10、100 ng/mL)重组人IL-17A的培养基，培养6 h后收集细胞，参照细胞总RNA提取试剂盒和real-time PCR试剂盒说明书进行操作。IL-6引物上游：5’-TGT AGC CGC CCC ACA CA-3’，下游：5’-GGA TGT ACC GAA TTT GTT TGT CAA-3’；MMP-13引物上游：5’-GAA TTA AGG AGC ATG GCG ACT T-3’，下游：5’-CCC AGG AGG AAA AGC ATG AG-3’；β-actin引物上游：5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’，下游：5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’。PCR反应条件：93 ℃ 3 min；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。以2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

四、统计学分析

结 果

一、IL-17A在胃癌和癌旁非癌组织中的表达

免疫组化染色结果显示，IL-17A阳性染色主要定位于细胞质，呈棕褐色颗粒样，细胞核无阳性染色。胃癌组织中IL-17A呈散在分布，主要表达于炎性细胞和血管内皮细胞；相应癌旁非癌组织有少量炎性细胞表达IL-17A。胃癌组织中IL-17A阳性细胞数较相应癌旁非癌组织显著增多(P=0.007)(见图1)。

二、IL-17A在胃癌细胞株中的表达

RT-PCR法检测结果显示，胃癌细胞株AGS、SGC7901、MKN45、MKN87、SUN1、SUN16中均无IL-17A mRNA表达(见图2)。

A、B: 胃癌组织；C、D：癌旁非癌组织

图2 IL-17A mRNA在胃癌细胞株中的表达

三、IL-17A对胃癌细胞增殖、凋亡的影响

MTT法检测结果显示，与对照组相比，IL-17A能显著刺激SGC7901细胞增殖，作用呈剂量和时间依赖性(见图3)。

流式细胞术检测结果显示，IL-17A 10、100 ng/mL组SGC7901细胞凋亡率较0 ng/mL 组显著降低(P<0.05)，10、100 ng/mL组间凋亡率无明显差异(P>0.05)(见图4)。

四、IL-17A对胃癌细胞IL-6、MMP-13 mRNA表达的影响

real-time RT-PCR法检测结果显示，IL-17A 10、100 ng/mL组SGC7901细胞IL-6、MMP-13 mRNA表达水平较0 ng/mL组显著上调，作用呈剂量依赖性(P<0.05)(见图5)。

图3 IL-17A对SGC7901细胞增殖的影响

图4 IL-17A对SGC7901细胞凋亡的影响

图5 IL-17A对SGC7901细胞IL-6、MMP-13 mRNA表达的影响

讨 论

IL-17是一种炎性细胞因子，在炎症反应中发挥重要作用，与类风湿性关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化、炎症性肠病等多种炎症性和自身免疫性疾病相关[4-5]。近年研究发现，IL-17在多种肿瘤组织中表达异常。Miyahara等[6]的研究显示，分离自卵巢癌组织的浸润性T细胞中，表达IL-17的Th17细胞比例较正常组织显著增高。Zhu等[7]的研究发现，乳腺癌组织中IL-17表达明显升高，其主要表达于肿瘤相关巨噬细胞、部分淋巴细胞以及多个核细胞，极少量表达于肿瘤细胞。Le Gouvello等[8]对结肠癌标本的研究显示，癌组织IL-17表达水平明显高于相应正常组织。Zhang等[3]的研究发现，肝细胞癌组织中的IL-17表达水平显著高于癌旁非癌组织，癌组织IL-17细胞密度与预后密切相关，有望成为预后指标和治疗靶点。

本研究分析了IL-17A在胃癌组织中的表达情况，发现胃癌组织中的IL-17A表达强度显著高于癌旁非癌组织，主要表达于炎性细胞和血管内皮细胞，该发现提示IL-17A可能与肿瘤血管生成有关。Numasaki等[9]的研究显示，IL-17可激发血管内皮细胞迁移，促进脉管形成，调节促血管生成因子分泌，从而促进肿瘤血管生成。此外，本研究还发现，体外重组人IL-17A可刺激胃癌细胞株SGC7901增殖，抑制H2O2诱导的细胞凋亡，提示IL-17A可能参与了胃癌的恶性演变进程。

IL-6是一种多功能细胞因子，参与调节细胞增殖、分化、免疫防御等过程。MMP-13属于间质胶原酶类，具有强大的胶原蛋白降解能力，在基质金属蛋白级联激活中起关键作用。IL-6和MMP-13在肿瘤侵袭、转移过程中发挥重要作用。IL-6可通过JAK/STATs途径活化STAT3，导致细胞异常增殖和凋亡障碍，并可促进肿瘤血管生成以及加剧肿瘤组织炎症等[10]。MMP-13表达受 MAPK信号通路控制，后者是IL-17A信号转导的重要通路之一[11-12]。本研究结果证实，IL-17A可上调胃癌细胞中的IL-6和MMP-13表达，作用呈剂量依赖性，提示IL-6和MMP-13在IL-17A参与的胃癌发生机制中可能起一定作用。

综上所述，本研究发现IL-17A在胃癌组织中呈高表达。体外IL-17A处理可刺激胃癌细胞增殖、抑制细胞凋亡，并上调其肿瘤相关炎性因子IL-6、MMP-13表达。IL-17A可直接或通过诱导炎症信号通路分子间接促进胃癌进展，有望成为胃癌治疗的新靶点。然而，目前IL-17A在肿瘤微环境中的作用尚未完全明确，其确切作用机制有待进一步研究。

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3 Zhang JP, Yan J, Xu J, et al. Increased intratumoral IL-17-producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients[J]. J Hepatol, 2009, 50 (5): 980-989.

4 Tesmer LA, Lundy SK, Sarkar S, et al. Th17 cells in human disease[J]. Immunol Rev, 2008, 223: 87-113.

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6 Miyahara Y, Odunsi K, Chen W, et al. Generation and regulation of human CD4+ IL-17-producing T cells in ovarian cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105 (40): 15505-15510.

7 Zhu X, Mulcahy LA, Mohammed RA, et al. IL-17 expression by breast-cancer-associated macrophages: IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines[J]. Breast Cancer Res, 2008, 10 (6): R95.

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