山葡萄种质资源收集、保存、评价与利用研究进展

李晓艳，杨义明，范书田，王振兴，艾军，沈育杰（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112）

山葡萄（V.amurensisRupr.）属于东亚种群，原产于我国东北、华北、朝鲜北部及俄罗斯远东地区，是葡萄属中最抗寒的一个种。野生山葡萄资源在我国长白山和小兴安岭山脉极为丰富，目前在东北三省、内蒙古中部地区栽培普遍，是我国野生果树驯化栽培最成功的果树之一。山葡萄的经济效益和社会效益主要体现在以下几个方面：一是酿造山葡萄酒的主要原料，山葡萄酒色为宝石红，鲜艳透明，风味独特，很受国内外消费者欢迎；二是山葡萄果实色素含量高，是生产天然色素的重要原料；三是由于纯种山葡萄对白粉病、黑痘病、炭疽病等有较强的抗性，尤其具有极强的抗寒性，是国内外葡萄抗寒、抗病育种的珍贵种质资源。

1 山葡萄种质资源的收集、保存与鉴定

1.1 种质资源的调查与收集

早在20世纪30年代初期，吉林省通化葡萄酒厂和长白山葡萄酒厂开始利用野生山葡萄浆果酿酒，并于1957年率先开始尝试人工栽培山葡萄。1953～1963年间，吉林省有关部门曾多次组织多家科研单位，数十次对我国东北山葡萄集中分布区的几十个县、市的山区、半山区进行资源调查。目前中国农业科学院特产研究所、吉林省农业科学院果树研究所、中国农业科学院郑州果树研究所、西北农林科技大学等单位保存部分山葡萄种质资源。中国农业科学院特产研究所自1961年设立山葡萄研究课题，收集和保存性状优异的野生山葡萄种质资源，其中包括在世界范围内首次发现的两性花山葡萄种质“双庆”和四倍体山葡萄种质“4N1”等[1]。

1.2 种质资源的保存

农业部1988年出资建立了国家种质左家山葡萄资源圃，挂靠在中国农业科学院特产研究所。该圃现保存种质资源400余份，主要来自黑龙江、吉林、辽宁和河北，其中从黑龙江收集的资源占65%以上。该资源圃是世界上保存山葡萄种质份数最多的资源圃，已成为全国山葡萄种质资源研究、教学及共享利用的平台及山葡萄生产示范和优良品种推广的基地。除了资源圃保存外，离体保存方法能够避免由于极端天气原因造成种质资源流失。其中组织培养技术已经是山葡萄优异种苗快速扩繁和种质资源离体保存的方法之一。早在1992年，王怀兰[2]对采用茎尖培养保存的种质和常规繁殖苗进行了对比实验，结果发现组培材料继代5a，分生能力正常，染色体无变异和常规苗相比，糖、酸及酿酒品质等无明显差异，宋润刚的研究进一步发现组培苗和硬枝扦插苗相比较，组培树比硬枝扦插树晚1a开花结果，在树形、叶形、果实形状和色泽、酒质、物候期、抗寒性等方面均未表现出明显的变异。组培树群体生长整齐一致，比扦插树增产4.15%，具有稳定的遗传性状和良好的生产性能[3-4]。之后，随着组织培养保存技术的完善，逐步建立了稳定的山葡萄组织培养方法和再生体系[5-7]。离体保存山葡萄种质资源虽然切实可行，但是保存费用较高。张志娥等[8]研究了山葡萄种子保存方法，发现室温保存的种子5a后全部丧失生活力，以-196℃，含水量3.5%的种子出苗率最高，达到74%，初步建立了低温或超低温保存种子的方法。

1.3 种质资源的鉴定及遗传多样性分析

山葡萄种质资源系统收集、保存有近30年的历史，由于不同地区相互引种，存在着同物异名、同名异物、品种混杂等现象，DNA指纹图谱为资源的鉴定提供了有力手段。王军等[9，10]首先利用RAPD技术对7份山葡萄种质进行了鉴定。金炳奎等[11]建立了山葡萄SRAP技术体系，利用2对引物就可鉴别6个山葡萄品种。吴子龙[12]、温景辉[13]、樊秀彩[14]等利用SSR标记技术对山葡萄种质资源进行了遗传多样性分析和山葡萄核心种质构建，明确了山葡萄种内亲缘关系和分类地位，SSR标记可以有效地对葡萄属种间杂交后代进行真实性鉴定，可作为葡萄种质创新的有效辅助手段。

2 山葡萄种质资源的深度评价

在山葡萄种质资源调查、收集和保存的基础上，我国学者对山葡萄资源进行了比较系统的整理和分类研究，并对部分资源进行了鉴定和评价，包括结实力、果实性状、果实品质等生物学性状评价[1，15]。除此外，近年来结合生物技术手段对山葡萄几个突出特点开展的了一系列的深度评价研究，包括抗寒性、抗病性、原花青素、遗传规律等几个方面。

2.1 山葡萄抗寒性评价及抗寒机制分析

贺普超等[16]采用生长法、组织褐变法和电导法对原产我国的10个野生种葡萄抗寒性研究后指出山葡萄最为抗寒。张文娥等[17]以枝条自然失水速率和枝条冷冻处理后的电导率、萌芽率为评价指标，利用隶属函数法综合评价了葡萄属12个种45份种质资源的抗寒性，结果表明山葡萄抗寒性最强。山葡萄枝蔓可耐-40℃低温，根系可耐-14～-16℃低温，在我国东北地区不经防寒可安全越冬。

随着分子生物学技术的发展和第二代高通量测序技术应用，可以从分子水平上对山葡萄抗寒机理进行分析，开发抗寒性状连锁的QTL定位和分子标记。刘镇东[18]采用SSR和SRAP两种分子标记技术分别构建了山葡萄“双优”和“北冰红”的分子遗传图谱，“双优”分子遗传图谱形成20个连锁群，包含233个位点，覆盖总图距为1254cm，位点之间平均距离为5.0cm；“北冰红”分子遗传图谱形成21个连锁群，包含228个位点，覆盖总图距为1123cm，位点之间平均距离为4.5cm。成功地对葡萄抗寒性进行了初步的QTL定位，在“双优”遗传图谱中检测到1个控制抗寒性的QTL位点，命名为SCR1，位于连锁群SY3上。在“北冰红”遗传图谱中检测到1个控制抗寒性的QTL位点，命名为BCR1，位于连锁群BBH14上。张剑侠等[19]利用RAPD技术找到与中国野生葡萄抗寒基因相连锁的分子标记S241-717和S238-854。针对山葡萄的高度抗寒性，分离到山葡萄低温诱导上调表达的抗寒转录因子VaCBF1[20]、CBF3[21]、CBF[22]和ICE1[23]等基因。袁红燕

[24]将山葡萄ICE基因导入“美人指”葡萄中，获得了转基因抗性株系。李海燕等[25]从山葡萄叶片中分离到一个维管组织特异表达的水杨酸强诱导型VCH3启动子。Haiping Xin等[26]利用Solexa测序技术对非冷处理和冷处理下的山葡萄茎尖表达谱进行了测序，在转录水平上对山葡萄抗寒机制进行了分析，两个文库中差异表达序列在20倍以上的序列有66个，这部分序列可能与抗寒性相关，其中冷调节蛋白COR27，在两个文库间的差异倍数高达332。

2.2 山葡萄抗病性评价及抗病机制分析

贺普超[27]、王跃进[28]、王国英[29]等采用室内接种和田间调查法研究野生葡萄的抗病能力，结果表明山葡萄对黑痘病表现为高抗；在自然条件下山葡萄不感染白腐病，但在接种后表现为抗性强；无论是在自然条件下还是室内接种，山葡萄均不感染白粉病；对霜霉病表现为感病。霜霉病（Plasmopara viticola）是山葡萄最主要的病害之一，高感品种年减产11.8%～25.9%，严重时可超过50%，甚至绝产[30]。山葡萄两性花品种“双庆”、“双丰”和雌能花品种“左山二”都因感病太重被生产淘汰[31]。李晓红[32]使用田间自然发病调查和室内离体叶圆片接种鉴定的方法，评价研究了150份山葡萄种质资源对霜霉病的感病性，结果表明在山葡萄种内虽然没有对霜霉病免疫的山葡萄品种，但不同种质之间感病性存在着明显的差异。

霜霉病是造成山葡萄减产的主要原因，但是目前尚未发现免疫品种或类型，也没有有效的药物能够根除此病[33]。了解诱发霜霉病的机制是解决这一难题的前提，Jiao Wu等[34]利用Solexa技术对山葡萄“左山一”感染霜霉病和未感染霜霉病叶片进行表达谱测序，在分子水平上对霜霉病诱发机制进行了分析，两个文库中差异表达序列在5倍以上的序列占0.9%，其中在感病文库中差异倍数超过20的序列有69条，这部分序列可能与霜霉病相关。针对山葡萄易感霜霉病，江源等[35]从山葡萄品种“双优”突变株中分离到降解病原真菌细胞壁功能的山葡萄PR蛋白-几丁质酶基因VCH3，并构建该基因的植物表达载体，为葡萄抗霜霉病的分子育种奠定了基础。

2.3 山葡萄功能性成分评价及合成途径分析

山葡萄籽中富含原花青素，其中黄酮类物质含量达12%，是欧亚种葡萄的4～8倍，是目前已知原花青素最丰富的资源[36]。王新伟等[36]采用香草醛-HPLC结合法对39份山葡萄种质资源的种子、果皮中原花青素含量进行测定，山葡萄种质资源原花青素含量存在较大变异，成熟果实种子与果皮原花青素含量变化幅度较大，变化范围分别为0.42～8.00mg/g FW和1.2～14.7mg/g FW。赵权等[37]以7个品种山葡萄为试验材料，应用HPLC－MS/MS技术，分析不同品种山葡萄果皮和酒中非花色苷酚成分的差异，包括苯甲酸类、肉桂酸类、黄烷－3－醇类、黄酮醇类、白藜芦醇类等，果皮中共检测出18种非花色苷，酒中共检测出30种非花色苷酚。

针对山葡萄花青素合成途径，李凤等[38]和李波等[39]成功构建了山葡萄“双红”成熟果皮和“双丰”转色期果皮cDNA文库，发现了花色苷合成途径和抗病防御的相关基因，如谷胱甘肽-S-转移酶、锌指蛋白、查尔酮合成酶和花青素3-O-葡萄糖苷转移酶等，为克隆山葡萄花色苷生物合成、果实成熟及防御抗病相关的基因提供了基础。刘海峰[40]从山葡萄成熟期果皮中克隆到了花青素合成途径的8个主要酶基因的cDNA全长序列，并对这些基因在山葡萄幼叶、成熟叶、茎、果肉和果皮中的表达进行了研究。Chen Wang等[41]利用Solexa技术对山葡萄小RNA文库进行了测序，共确定了27个miRNA家族的126个保守miRNAs，发现72个新的潜在的山葡萄特定的miRNA，对346个新的miRNA的靶基因进行了预测，包括一些抗逆性基因、花青素的合成和糖代谢调节基因等。

2.4 山葡萄遗传规律研究

为研究山葡萄抗寒力在种间杂交后代中的遗传规律，王军等[42]对4种杂交模式82个杂交组合的近8000株杂种苗抗寒力进行了调查，发现（AA山×BB欧）F1×AA（山）的抗寒力最强，（AA山×BB欧）F1×BB（欧）后代抗寒力最弱。林兴桂[43]对山葡萄种内杂交后代抗寒力、花型和果实性状的遗传进行了研究，发现杂种一代抗寒力未出现分离，雌能花与雄花、雌能花与两性花的比例均接近1∶1，果穗重量超亲的植株占30.12%～90.03%。

中国农业科学院特产研究所于1973～2005年间，用低酸高糖抗寒的种质资源山葡萄（品种、品系）进行种内杂交，再与不抗寒的欧亚种葡萄中著名的酿酒品种进行种间杂交、回交和重复杂交，以使这些种质优良性状组合在一起，试图摸索出山葡萄种内和种间杂交后代果实总酸和糖含量遗传规律。结果发现山葡萄种间杂交后代F1～F4对霜霉病抗性分离，表现为连续分布，倾向于抗病亲本。霜霉病抗性为多基因控制的数量性状遗传、“抗病基因”有累加效应、呈显性遗传给后代。已选育出抗霜霉病、抗寒、可酿造干红山葡萄酒的新品种左优红、品系94-7-75、94-8-168、95-2-482 和 2002-1-135[31，44]。山葡萄种内和种间杂交后代（F1，F2）果实成熟期分离，表现为连续分布，倾向于早熟亲本。杂交组合中早熟亲本越多，分离出的早熟单株越多，为多基因控制的数量性状遗传。“早熟基因”有累加效应、呈显性遗传给后代[45]。果实总酸含量主要受双亲遗传因素的影响，趋向高酸亲本；后代果皮色素（色价）群体表现为趋中变异，但也受杂交亲本相互影响，单宁平均含量均都比高单宁亲本高，表现为超亲遗传[46-47]。

山葡萄花型的遗传符合Levadou的假说，受M、H、F这3个等位基因控制[48]。野生状态下，雄花植株基因型为异质MF，目前发现唯一的两性花种质资源“双庆”基因型为异质HF，雌能花植株基因型为FF。人工杂交以后可以产生基因型为HH的两性花植株和基因型为MH的雄花植株。目前山葡萄植株性别分雌株、雄株和两性花3种类型。中国农业科学院特产研究所从2002年起开展对山葡萄雄株进行性别转换研究，已经建立了稳定的山葡萄雄株性反转调控体系，山葡萄雄株花序经过100mg/L的CPPU处理后转变成了两性花，并从雌雄配子体发育[49]、花粉萌发、果实性状、内源激素、蛋白质组学等方面揭示了山葡萄雄株花朵性别转换与各因素间的内在联系[50]。Xu等[51]发现腺嘌呤磷酸核糖基转移酶是山葡萄雄株性别转换的关键蛋白质，直接或间接参与山葡萄花器官的生长发育。另外，利用分子生物学手段找到了和山葡萄性别相关的分子标记。王军等[52，53]利用RAPD技术找到雄性山葡萄相关标记OPA18-700。唐美玲等[54]利用AFLP技术找到与山葡萄雄花与两性花相关的分子标记并成功转化成SCAR标记，盲测准确率达到97.6%，可对山葡萄杂交后代在苗期进行性别鉴定，提高育种效率。

3 山葡萄种质资源的利用

山葡萄是我国东北地区酿制著名山葡萄酒的原料，为了筛选适宜加工的山葡萄品种，多家科研单位通过野外实生选种、种内杂交、种间杂交等育种途径，开展了山葡萄品种选育（表1）和配套栽培技术研究。

中国农业科学院特产研究所是国内开展山葡萄研究比较早的单位之一，1963年从野生资源中发现两性花山葡萄，1975年命名“双庆”，成为我国第一个两性花山葡萄品种[1]。1984～1988年从野生资源中选育出“左山一”和“左山二”2个雌能花品种，并进行大面积生产栽培，使山葡萄每公顷平均产量达到 12～14t[55，56]。1974 年开始了以“双庆”为父本，优良雌能花品系为母本进行种内杂交选育两性花新品种的研究，从杂交一代中选育出“双丰”、“双红”和“双优”3个两性花品种，使山葡萄每公顷产量达到 15～17t[57，58]。1973～2014 年，开展山葡萄（品种、品系）种内杂交，再与不抗寒的欧亚种葡萄进行种间杂交、回交和重复杂交，先后选育出优良的种间杂交品种“左红一”、“左优红”、“北冰红”、“雪兰红”，使山葡萄每公顷平均产量达到20～22t[59-62]。这些品种不但很好的保持了山葡萄的典型特征，更具有产量高、酒质好等特点。

表1 培育和审定的山葡萄品种简介

另外，吉林省农科院果树所采用“玫瑰香”和山葡萄进行杂交，选育出“公酿一号”和“公酿二号”2个优良品种[63]。中国科学院植物研究所同样采用“玫瑰香”和山葡萄的杂交组合形式，选育出“北醇”、“北玫”和“北红”3个优质抗寒新品种[64-66]。黑龙江省牡丹江市果树所从野生资源中选出优良单株，命名“牡山1号”[67]。这些品种及栽培技术先后在我国东北三省及内蒙古推广，目前我国山葡萄的栽培面积已达到1.23万hm2左右[63]。

4 山葡萄种质资源未来的研究方向

4.1 扩大山葡萄种质资源的收集范围，建立高效的保存方法

山葡萄种质资源分布较广，遗传多样性十分丰富，除了注重对具有特异性状，如抗病、高糖、低酸、两性花山葡萄种质资源的收集，还要加强国外优异资源的收集，尤其是与俄罗斯等研究较早和深入的国家建立交流与合作关系，引进特色山葡萄品种和品系。开展超低温保存方法的研究，确定最佳的外植体的保存类型和保存方法。

4.2 建立完善的评价体系，开展特异性状的深度评价

建立山葡萄抗寒性、抗病性、耐盐性评价体系，并对其抗性机制进行分析，筛选抗性种质和抗性基因。开展山葡萄特异性状和对人体有益的功能性成分的评价，如白藜芦醇、原花青素等，筛选优异种质资源，将有利于山葡萄资源的高效利用。

4.3 调整育种目标，突出研究重点

山葡萄育种目标应从单纯的高产、优质转为以优质为基础的综合抗逆性强的品种上来，把抗霜霉病作为今后育种的重点。充分利用现有资源，选育优异的两性花品种、培育白果山葡萄、小叶山葡萄是将来的育种目标。

4.4 选择优异的杂交组合，对特异性状进行分子标记和基因定位

分子标记辅助育种手段在山葡萄上的应用更多地体现在种质资源的鉴定和遗传多样性分析，而真正对主要经济性状的分子标记报道较少。随着第二代测序技术的推广和应用，更多的SSR和SNP被发掘，可以构建高密度的山葡萄遗传图谱，有目的选择杂交组合，构建优异的杂交组合群体，对特异性状如抗寒、抗病基因进行QTL定位和分析。

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