霸王花褐腐病的病原鉴定

蓝国兵，何自福，罗方芳，汤亚飞，佘小漫，杜振国

(1广东省农业科学院植物保护研究所，广东广州 510640;2广东省植物保护新技术重点实验室，广东广州 510640)

霸王花褐腐病的病原鉴定

蓝国兵1，2，何自福1，2，罗方芳1，汤亚飞1，佘小漫1，杜振国1

(1广东省农业科学院植物保护研究所，广东广州 510640;2广东省植物保护新技术重点实验室，广东广州 510640)

【目的】明确导致广东省霸王花Hylocereus undatus褐腐病的病原种类.【方法】通过病组织分离、致病性测定、形态学观察及rDNA序列分析等方法对广东省霸王花褐腐病病原进行了种类鉴定.【结果和结论】在PDA培养基上，病原菌的菌落为深灰色，绒毛状.产生2种类型的节孢子：一种为浅色、薄壁的柱状孢子，大小为(5.00～10.69)μm ×(2.61～4.52)μm;另一种为褐色、厚壁、圆形或椭圆形、基部平截、成链的孢子，大小为(5.15～12.39)μm× (3.87～6.07)μm.应用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR，获得该病原菌579 bp的18S-28S rDNA ITS序列.BLAST结果显示，该序列与Neoscytalidium dimidiatum火龙果菌株的18S-28S rDNA ITS序列相似性最高，为99%～100%.这些研究结果表明，引起广东省霸王花褐腐病的病原菌为N.dimidiatum.

霸王花;褐腐病;病原鉴定

霸王花Hylocereus undatus(Haw.)Britt.et Rose又名剑花、量天尺等，属仙人掌科量天尺属，分布于澳大利亚、美国以及我国广东、广西、福建、海南、台湾等地［1-2］.霸王花的花朵具有食用和药用价值，其花的加工产品在国内外市场十分畅销，主要用作汤料或蔬菜食用，具有强身健体、清补养生功效［3］.近年来，随着人工栽培面积的不断扩大，霸王花病害问题日益突出，严重地影响了霸王花的生产.2011年秋，在广东省台山市冲蒌镇的霸王花种植区暴发了一种新病害.病株茎秆上先出现褐色近圆形病斑，病情发展较快，病斑扩大且数量不断增多，最终导致茎秆腐烂枯死.为了弄清霸王花褐腐病的病原，为病害防治提供科学依据，本研究对引起霸王花褐腐病的病原进行了鉴定.

1 材料与方法

1.1 材料

霸王花褐腐病的病样采集于广东省台山市冲蒌镇.观察所用显微镜型号为ECLIPSE 90i显微镜，尼康公司产品.试验所用试剂主要购自TaKaRa公司，引物ITS1和ITS4合成于上海英俊生物技术有限公司.

1.2 病原菌分离、纯化和致病性测定

采用植物病原真菌病组织常规分离法［4］进行病原菌分离.菌株经单孢分离纯化后，保存于PDA斜面上，置于4℃冰箱中保存备用.采用菌丝块接种和孢子悬浮液注射接种2种方法，分别对分离菌株的致病性进行测定.菌丝块接种方法为：将分离菌株BWH-TS1在PDA平板上活化，27℃培养3 d后用直径为0.5 cm的打孔器在菌落边缘打孔，然后将菌饼置于经清水洗净的健康霸王花茎秆上(用挑针造成微伤口)，以PDA块做空白对照.孢子悬浮液注射接种方法为：将菌株BWH-TS1在PDA平板上27℃活化培养7 d，然后用无菌水将孢子洗下，并配成浓度为1×106mL-1的孢子悬浮液，用无菌注射器将100 μL的孢子悬浮液注射到健康的霸王花茎秆内，注射等量无菌水的健康植株为空白对照.每处理3个重复，27℃黑暗保湿培养，接种后3～15 d观察发病情况，并对接种后发病的组织进行病原菌再分离.

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 形态学观察将待鉴定的病原菌株在PDA平板上活化，27℃培养30 d，不定期观察菌落特征，包括菌落大小、颜色、分泌物和质地等，显微镜下观察产孢结构和孢子形态特征，并测量分生孢子大小.根据真菌分类有关文献［5-8］进行鉴定.

1.3.2 病原菌rDNA-ITS序列分析CTAB法［9］提取病原菌菌株BWH-TS1基因组DNA.以真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增［10］.PCR反应体系(50 μL)：DNA模板1.5 μL(20～30 ng)，引物ITS1 (10 μmol/L)和ITS4(10 μmol/L)各2 μL，Premix ExTaq®Version 2.0 25 μL(TaKaRa公司)，ddH2O 19.5 μL.PCR扩增程序：95℃预变性6 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，进行35个循环;最后72℃延伸10 min.在质量浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶上检测PCR结果，对PCR扩增获得的约600 bp特异片段进行克隆，送上海生工生物技术有限公司测序，并进行BLAST同源性比对.

2 结果与分析

2.1 霸王花病株田间症状

霸王花植株感病后，症状最初表现为茎秆表皮产生许多褪绿小病斑，15 d左右病斑上形成近圆形黄褐色凸起小斑点，病斑直径大小2～5 mm.随着病情的发展，病斑不断增多，病斑不断扩大，甚至多个病斑连在一起形成更大的病斑，呈褐色或深褐色.后期病斑连成一片，病斑组织腐烂，造成整条茎秆腐烂枯死(图1).

图1 霸王花褐腐病的症状Fig.1 Symptoms of plants caused by Hylocereus undatus

2.2 病原菌致病性测定结果

通过植物病原真菌常规病组织分离方法，分离获得3株形态一致的菌株，选取其中1株(菌株编号为BWH-TS1)用于致病性测定.将菌株BWH-TS1的菌丝块接种在用挑针造成微伤口的健康霸王花茎秆上，27℃条件下，3 d后即能观察到水浸状的小病斑出现;病斑随后慢慢扩大，接种15 d后形成直径为

1.3 cm左右褐色病斑，与田间症状相同，而对照没有表现症状(图2).菌株BWH-TS1孢子悬浮液注射接种在霸王花茎秆上，27℃条件下，3 d后也出现水浸状的病斑，接种7 d后病斑扩展到1.0 cm左右，与病害的田间后期症状基本一致，对照没有病症(图2).对接种后发病的组织进行再分离，均能获得与接种菌株形态一致的病原菌.因此，菌株BWH-TS1为霸王花褐腐病的致病菌.

图2 霸王花茎秆接种菌株BWH-TS1的症状Fig.2 Symptoms of the night-blooming cereus stem inoculated with strain BWH-TS1

2.3 病原菌形态学鉴定结果

在PDA培养基上，霸王花病原菌株菌落初期浅白色，平铺;后期菌落呈深灰色，绒毛状.菌落生长较快，27℃黑暗培养3 d菌落直径即可达9 cm(图3).在PDA培养基上，该病原菌可产生2种类型的节孢子(图3)：一种是由菌丝或侧生菌丝断裂产生的浅色、薄壁的柱状孢子，孢子大小为7.83(5.00～ 10.69)μm×3.60(2.61～4.52)μm;另一种是由菌丝厚垣化断裂形成的褐色、厚壁、圆形或椭圆形、基部平截、成链的孢子，孢子大小为7.09(5.15～12.39)μm×4.69(3.87～6.07)μm.没有观察到该菌的有性阶段.根据这些特征，结合相关文献［5-8］，将引起广东省霸王花褐腐病的病原菌初步鉴定为Neoscytalidium dimidiatumCrous＆Slippers.

图3 病原菌Neoscytalidium dimidiatum的形态观察Fig.3 Morphological characteristics of Neoscytalidium dimidiatum

2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析结果

应用真菌18S-28S rDNA间隔区序列(ITS)的通用引物ITS1和ITS4，从菌株BWH-TS1的DNA中PCR扩增到一条约600 bp的片段.序列测定结果显示，该特异片段长度为579 bp(GenBank No.JX473739).BLAST比对结果表明，BWH-TS1 18S-28S rDNA ITS序列与已报道的侵染火龙果的N.dimidiatum中国台湾菌株(HQ439174)的序列相似性为99%，与N.dimidiatum广东菌株(JX128103，JX128104，JX524168)的序列相似性为100%.该结果进一步支持引起霸王花褐腐病的病原菌为N.dimidiatum.

3 讨论与结论

应用常规的植物病原真菌研究方法，从霸王花病样组织中成功分离获得病原菌.根据该病原菌的形态学特征及其18S-28S rDNA ITS序列，将该病原菌鉴定为半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、暗色孢科、新节格孢属的Neoscytalidium dimidiatum.

霸王花和火龙果H.undatus＆H.polyrhizus在形态上十分接近，均为仙人掌科量天尺属Hylocereus植物，但在生产中霸王花只开花不结果［11］.2012年，我国台湾和广东相继报道了N.dimidiatum侵染引起的火龙果茎腐病［7-8］，其病害症状与发生在霸王花上的褐腐病症状相似，这说明N.dimidiatum不仅可以侵染霸王花，而且也侵染火龙果.

新节格孢属Neoscytalidium是Crous等［6］对Botryosphaeriaceae发育系统研究中建立的一个新属，模式种为N.dimidiatum.该属的主要特征是：在呈粉末状气生菌丝上产生链状分生节孢子;节孢子易断裂脱落，基部平截，圆柱形或钝椭圆形，暗褐色，细胞壁厚，0～2隔膜.自该属建立以来，国内外已有一些文献报道了N.dimidiatum侵染引起的病害，如发生在意大利的甜橙Citrus sinensis枝条溃疡病［12］、美国加州的无花果Ficus carica枝枯病［13］、澳大利亚的猢狲树Adansonia perrieri枝枯病［14］、我国台湾和广东的火龙果茎腐病［7-8］等.可见，该病原菌的寄主比较广泛，可以侵染多种重要经济作物，造成枝枯、溃疡及茎腐等症状，但在仙人掌科上的危害目前已报道的仅有量天尺属Hylocereus［7-8］.另外，也有研究者［15］将导致火龙果果实腐烂的病原菌鉴定为Scytalidium dimidiatum(Penz.)Sutton and Dyko，而Scytalidium dimidiatum为N.dimidiatum的同物异名.

2012年3—6月，广东雨水比往年偏多，高温潮湿的天气导致霸王花褐腐病发生特别严重，在部分霸王花种植区暴发流行，导致毁园失收.对于该新病害的发生规律及病害防治有效药剂筛选等研究还在进行.

致谢：华南农业大学姜子德教授和习平根副教授在病原菌鉴定方面给予了指导，特此致谢!

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【责任编辑霍欢】

Identification of the pathogen causing brown rot of Hylocereus undatus

LAN Guobing1，2，HE Zifu1，2，LUO Fangfang1，TANG Yafei1，SHE Xiaoman1，DU Zhenguo1(1 Institute of Plant Protection，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China; 2 Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou 510640，China)

【Objective】To confirm the pathogen species that caused brown rot disease onHylocereus undatus.【Method】Diseased tissue isolation，indoor pathogenicity test，morphological observation and rDNA sequence analysis were used to confirm the pathogen species.【Result and conclusion】The colonies of the fungus were dark grey and fluffy on potato dextrose agar(PDA)medium.Two kinds of arthrospore were observed on PDA medium.One was columnar conidium with light-colored，thin-walled and(5.00-10.69)μm×(2.61-4.52)μm in size，and the other was chained conidium with dark brown，thickwalled，circular or oval，base truncate and(5.15-12.39)μm×(3.87-6.07)μm in size.Using PCR with primers ITS1 and ITS4 for internal transcribed spacer(ITS)sequences of fungal 18S-28S rDNA，the sequence was cloned to be 579 bp in length.The BLAST results showed that the sequence had the highest sequence identity with that ofNeoscytalidium dimidiatumstrains isolated from pitahaya (99%-100%).These results indicated that night-blooming cereus brown rot in Guangdong was caused byN.dimidiatum.

Hylocereus undatus;brown rot;pathogen identification

S436.418.11

A

1001-411X(2014)01-0060-04

蓝国兵，何自福，罗方芳，等.霸王花褐腐病的病原鉴定［J］.华南农业大学学报，2014，35(1)：60-63.

2013-02-21优先出版时间：2013-11-07

优先出版网址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1611.019.html

蓝国兵(1984—)，男，硕士，助理研究员，E-mail:languo020@163.com;通信作者:何自福(1966—)，男，研究员，博士，E-mail:hezf@gdppri.com

星火计划重点项目(2011GA780007);国际科技合作项目(2011DFB30040);广东省现代农业产业技术体系创新团队专项