多种方法提取苎麻组织基因组DNA的质量比较

张平+夏东升+蔡亚君+曾庆福+王军

摘要:以苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaudich.]的纤维成熟期韧皮组织､种子和根组织为试验材料,采用CTAB法､SDS法和尿素法提取苎麻基因组DNA｡3种DNA提取方法比较,CTAB法提取的DNA质量优于其他两种方法;3种试验材料比较,韧皮组织提取的DNA质量最好,其次是种子和根组织｡种子提取的DNA浓度最高｡设计梯度试验分析不同研磨时间对韧皮组织和种子总DNA提取质量的影响,结果显示韧皮组织研磨4 min､种子研磨6 min提取的总DNA质量较好｡

关键词:苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaudich.];基因组DNA;提取;组织;CTAB法;SDS法;尿素法

中图分类号:R281.4;Q7文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2682-04

Comparison of the Genomic DNA Extraction Methods From Different Ramie Tissues

ZHANG Ping,XIA Dong-sheng,CAI Ya-jun,ZENG Qing-fu,WANG Jun

(Engineering Research Center for Cleaner Production of Textile Dying and printing Under Ministry of Education,

Wuhan Textile University,Wuhan 430073,China)

Abatract: Extraction of high quality genomic DNA from Ramie tissue is the foundation for the study of molecular biology of ramie. In order to study ramie genome by some molecular test, such as PCR , In this study, CTAB, SDS and urea methods were used to extract the ramie genomic DNA from the phloem tissue of ramie fiber mature phase, seed and root tissue respectively. The DNA extraction effect of three different tissues and methods were compared by ultraviolet spectrophotometry and agarose electroforesis. The results showed that the extraction effect of CTAB method is best than the other two method; the extraction effect of the phloem tissue of ramie fiber mature phase is best in three different tissues, follow by the seed and root tissue. The seed is able to extract high quantity genomic DNA in three extraction methods. In addition we study different milling time of the phloem tissue and seeds to total DNA quality effect by used CTAB and SDS methods. The results showed that the phloem tissue grinding for 4min, seed tissue grinding for 6 minutes can get high quality DNA.

Key words:Boehmeria nivea(L.)Gaudich.;ramie genomic DNA;extraction; tissues; CTAB methods; SDS method; urea method

基金项目:湖北省教育厅优秀中青年科技人才项目(Q20081704);武汉科技学院青年基金项目(20073204);中国纺织工业协会项目(2006074);国家科技支撑计划项目(2010BA02B00);苎麻生态高值利用技术研究与产品开发项目(2012BAD36B03-04)

苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaudich.]是中国特有的传统纤维作物,其纤维具有吸湿散热快､透气好､不贴身､抗菌､挺括美观等优点,具有“天然纤维之王”的美誉｡现有的中国苎麻品种纤维细度比较粗､刚度大,因此迫切需要选育低结晶度､低取向度､高纤维支数的苎麻新品种,以改善纤维性能[1]｡苎麻DNA的提取和纯化是其分子研究的基础｡随着植物分子生物学工作的广泛开展,建立了各种各样的基因组DNA提取方法[2]｡目前,常用的有十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法[3]､十二烷基磺酸钠(SDS)法[4]､尿素法[5]等｡每种DNA提取和纯化方法的原理基本相同,均包括破碎细胞､释放DNA､去除杂质､分离DNA等一系列步骤｡植物组织中含有蛋白质､多糖类化合物及各种次生代谢产物,在提取过程中影响DNA的质量及纯度｡另外次生代谢产物中的酚类化合物可导致DNA降解,抑制限制酶､连接酶及DNA聚合酶等酶类的生物活性,从而影响后续的分析检测[2,6]｡

目前,对苎麻基因组DNA提取的研究大都选用幼嫩叶片[7-10]､种子萌发期黄化苗[7]等组织,而对最有研究价值的苎麻纤维组织基因组DNA提取至今仅有极少的报道[11],因此本研究选用3种不同方法(CTAB法､SDS法､尿素法)提取苎麻成熟期纤维韧皮组织､种子､根组织的基因组DNA,比较提取效果,以期获得最佳的不同苎麻组织基因组DNA提取方法｡

1材料与方法

1.1试验材料

苎麻品种为中苎1号,样品采于湖北新农生态麻业有限公司｡取同株苎麻纤维成熟期的韧皮组织､种子､根组织｡韧皮纤维组织用酒精棉球擦拭处理,种子和根组织用灭菌生理盐水冲洗､酒精棉球擦拭处理,各组织处理完毕置于液氮内冷冻后,-70 ℃保存备用｡

1.2试剂配方

1.2.1CTAB提取液称取1.211 g Tris-Base,8.19 g NaCl,0.7 44 4 g EDTA,2.0 g CTAB溶于100 mL去离子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巯基乙醇,40 ℃水浴溶解｡

1.2.2SDS提取液称取1.211 g Tris-Base,2.925 g NaCl,1.816 g EDTA,1.5 g SDS溶于100 mL去离子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巯基乙醇 ,40 ℃水浴溶解｡

1.2.3尿素提取液称取0.048 g尿素,2.047 g NaCl,1.861 g EDTA溶于100 mL去离子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巯基乙醇,40 ℃水浴溶解｡

1.3苎麻DNA的提取

1.3.1试验设计方案试验设计方案及所提取DNA的编号见表1｡

1.3.2CTAB法

1)将1 g冰冻苎麻韧皮纤维组织放入盛有液氮的研钵中,用研杵将其磨成粉末,研磨过程不断添加液氮以保持组织冷冻｡

2)把组织粉末转移至Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL CTAB提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)待样品冷却至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液混匀,轻轻颠倒几次离心管使管内混合物成为乳浊液,常温下10 000 r/min离心10 min,取上清液转入另一干净离心管中｡

4)重复步骤3一次｡

5)取步骤4上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

6)弃去上层有机溶剂,加入500 μL 75 %乙醇洗涤沉淀,4 ℃下10 000 r/min离心5 min弃去上清,洗涤沉淀3次｡

7)倒置或者37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号C1､C2､C3｡

8)加入50 μL去离子水溶解DNA,于-20 ℃冷藏备用｡

1.3.3SDS法

1)同“1.3.2”中CTAB法步骤1｡

2)把粉末转移至Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL的SDS提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)再加入200 μL 5 mol/L KAC,冰浴20 min｡

4)同“1.3.2”中CTAB法步骤3｡

5)重复步骤4｡

6)取步骤5的上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

7)同“1.3.2”中CTAB法步骤6｡

8)倒置或者37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号S1､S2､S3｡

9)同1.3.2中CTAB法步骤8｡

1.3.4尿素法

1)同“1.3.2”中CTAB法步骤1｡

2)把粉末转移到Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL的尿素提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)同“1.3.2”中CTAB法步骤3｡

4)重复步骤3一次｡

5)取步骤4上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

6)同“1.3.2”中CTAB法步骤6｡

7)倒置或者于37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号N1､N2､N3｡

8)同“1.3.2”中CTAB法步骤8｡

1.4不同研磨时间对DNA提取质量的影响

本试验选用两种DNA提取液(CTAB和SDS提取液)对两种苎麻组织(纤维成熟期的韧皮组织､种子)进行不同研磨时间(2､4､6 min)的处理,操作方法及步骤同“1.3”中CTAB法和SDS法,比较研磨处理时间对提取出的DNA质量的影响｡试验设计及所提取的DNA编号见表2｡

1.5提取DNA的质量检测

1.5.1琼脂糖凝胶电泳法配制1.0%琼脂糖凝胶,苎麻总DNA上样量为5 μL,在0.5×TEB缓冲液中,电压100 V电泳15 min,在凝胶成像系统上观察并拍照｡

1.5.2紫外分光光度法取10 μL DNA,加TE溶液稀释200倍,测定DNA OD260 nm和OD280 nm,以检测DNA的浓度和纯度｡

2结果与分析

2.1不同方法对苎麻组织DNA提取质量的影响

同一组织不同方法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳对照结果见图1｡由图1可见,CTAB法提取的DNA条带最清晰,SDS法的DNA条带次之,尿素法的条带最模糊｡3种方法提取的纤维成熟期韧皮组织的DNA质量均比其他两种组织提取的DNA质量好,其中SDS法优于CTAB法和尿素法,CTAB法提取的种子DNA质量优于其他两种方法,3种方法提取的根组织DNA质量没有明显差异｡

紫外分光光度法检测结果见表3｡由表3可见,CTAB法提取的纤维成熟期韧皮组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm比值大于2,种子和根组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm分别为1.97和1.83,均介于1.8~2.0,总体最优｡SDS法和尿素法提取的3种组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm比值均小于1.8,说明含有蛋白质或者酚类物质,二者比较,尿素法稍好于SDS法｡3种组织比较,纤维成熟期韧皮组织的总DNA质量最好,种子和根组织的DNA质量差别不大｡

由表3可见,取等质量不同组织的材料,加入等量的提取缓冲液,CTAB法提取的DNA总量高于SDS法和尿素法提取的量,尿素法提取的种子和根组织的DNA总量高于SDS法提取的量,SDS法提取的纤维成熟期韧皮组织的DNA总量高于尿素法提取的量｡对比3种组织DNA提取量,种子>纤维成熟期韧皮组织>根组织｡

2.2不同研磨时间对组织DNA提取质量的影响

两种组织不同研磨时间提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳结果见图2｡由图2可见,CTAB法的条带较SDS法的条带更为清晰明亮｡不同研磨时间对纤维成熟期韧皮组织DNA质量无明显影响,对种子的DNA质量有较明显的影响,研磨时间越长提取的DNA质量越高｡

由表4可知,CTAB法提取的纤维成熟期韧皮组织DNA质量稍优于SDS法,而SDS法提取的DNA浓度远高于CTAB法｡从研磨时间来看,纤维成熟期韧皮组织研磨4 min提取的DNA(C2)质量最优,种子研磨6 min提取的DNA(S3)质量较好｡

3小结与讨论

对比不同方法提取的苎麻不同组织总DNA质量,CTAB法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳条带较为清晰,DNA质量最好,其次是SDS法,尿素法提取的DNA质量较差｡对比不同苎麻组织提取的总DNA质量,纤维成熟期韧皮组织中提取的DNA质量最好,种子和根组织提取的DNA质量差别不大｡对比不同组织提取的总DNA浓度,种子提取的DNA浓度最高,其次是韧皮组织和根组织,这可能与不同植物组织的细胞含量差异有关｡综上所述,用CTAB法提取的DNA质量最好,适用于提取苎麻基因组DNA｡

由于不同植物组织结构的差异,排除人为操作等外界因素,在提取总DNA过程中对研磨时间有不同的要求｡本研究表明韧皮组织研磨4 min,种子研磨6 min时,提取的DNA质量较好｡苎麻韧皮组织具有较高的纤维含量,研磨时间短导致细胞破裂不充分,影响DNA的得率,研磨时间过长,组织中所含的糖类等内含物会与DNA一起释放出来,影响DNA的质量｡种子由于细胞含量较多故较韧皮组织需要更长的研磨时间,其次较多的细胞数量也是种子DNA浓度较大的主要原因｡该研究结果为苎麻不同组织总DNA的提取和利用奠定了基础｡

参考文献:

[1] 喻春明,张彦红,朱爱国,等.苎麻种质资源纤维结晶度变异及其主要品质性状的关联分析[J].中国麻业科学,2011,33(5):223-231.

[2] 易庆平,罗正荣,张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学,2007,35(25):7789-7791.

[3] 李艺,铁双贵,朱卫红,等.快速CTAB法提取玉米种子胚基因组DNA[J].河南农业科学,2008(2):17-20.

[4] 单志,吴宏亮,李成磊,等.改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究[J].广东农业科学,2011(8):113-115.

[5] 曹文波,郑璐璐,谢文海.一种提取植物基因组DNA的方法—改良尿素法[J].华中师范大学学报(自然科学版),2008,4(3):448-451.

[6] 张宁,王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物,2004(2):40-46.

[7] 郭新波,臧巩固,赵立宁,等.苎麻野生近缘种植物基因组DNA提取技术的改进[J].中国麻业科学,2008,30(1):28-32.

[8] 邱财生,程超华,赵立宁,等.用RAPD标记研究苎麻属植物的亲缘关系[J].湖北农业科学,2011,50(7):1499-1501.

[9] 侯思名,段继强,梁雪妮,等.苎麻总DNA提取的CTAB法优化方案[J].西北植物学报,2005,25(11):2193-2197.

[10] 黄小英,刘瑛,赖小萍,等.一种适提取野生苎麻总DNA的方法[J].中国野生植物资源,2002,21(1):56-57.

[11] 陈平,谭龙涛,喻春明,等.一种适用于PCR检测的苎麻陈麻原麻DNA提取方法[J].中国麻业科学,2012,34(6):249-251.

1.2.3尿素提取液称取0.048 g尿素,2.047 g NaCl,1.861 g EDTA溶于100 mL去离子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巯基乙醇,40 ℃水浴溶解｡

1.3苎麻DNA的提取

1.3.1试验设计方案试验设计方案及所提取DNA的编号见表1｡

1.3.2CTAB法

1)将1 g冰冻苎麻韧皮纤维组织放入盛有液氮的研钵中,用研杵将其磨成粉末,研磨过程不断添加液氮以保持组织冷冻｡

2)把组织粉末转移至Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL CTAB提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)待样品冷却至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液混匀,轻轻颠倒几次离心管使管内混合物成为乳浊液,常温下10 000 r/min离心10 min,取上清液转入另一干净离心管中｡

4)重复步骤3一次｡

5)取步骤4上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

6)弃去上层有机溶剂,加入500 μL 75 %乙醇洗涤沉淀,4 ℃下10 000 r/min离心5 min弃去上清,洗涤沉淀3次｡

7)倒置或者37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号C1､C2､C3｡

8)加入50 μL去离子水溶解DNA,于-20 ℃冷藏备用｡

1.3.3SDS法

1)同“1.3.2”中CTAB法步骤1｡

2)把粉末转移至Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL的SDS提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)再加入200 μL 5 mol/L KAC,冰浴20 min｡

4)同“1.3.2”中CTAB法步骤3｡

5)重复步骤4｡

6)取步骤5的上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

7)同“1.3.2”中CTAB法步骤6｡

8)倒置或者37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号S1､S2､S3｡

9)同1.3.2中CTAB法步骤8｡

1.3.4尿素法

1)同“1.3.2”中CTAB法步骤1｡

2)把粉末转移到Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL的尿素提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)同“1.3.2”中CTAB法步骤3｡

4)重复步骤3一次｡

5)取步骤4上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

6)同“1.3.2”中CTAB法步骤6｡

7)倒置或者于37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号N1､N2､N3｡

8)同“1.3.2”中CTAB法步骤8｡

1.4不同研磨时间对DNA提取质量的影响

本试验选用两种DNA提取液(CTAB和SDS提取液)对两种苎麻组织(纤维成熟期的韧皮组织､种子)进行不同研磨时间(2､4､6 min)的处理,操作方法及步骤同“1.3”中CTAB法和SDS法,比较研磨处理时间对提取出的DNA质量的影响｡试验设计及所提取的DNA编号见表2｡

1.5提取DNA的质量检测

1.5.1琼脂糖凝胶电泳法配制1.0%琼脂糖凝胶,苎麻总DNA上样量为5 μL,在0.5×TEB缓冲液中,电压100 V电泳15 min,在凝胶成像系统上观察并拍照｡

1.5.2紫外分光光度法取10 μL DNA,加TE溶液稀释200倍,测定DNA OD260 nm和OD280 nm,以检测DNA的浓度和纯度｡

2结果与分析

2.1不同方法对苎麻组织DNA提取质量的影响

同一组织不同方法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳对照结果见图1｡由图1可见,CTAB法提取的DNA条带最清晰,SDS法的DNA条带次之,尿素法的条带最模糊｡3种方法提取的纤维成熟期韧皮组织的DNA质量均比其他两种组织提取的DNA质量好,其中SDS法优于CTAB法和尿素法,CTAB法提取的种子DNA质量优于其他两种方法,3种方法提取的根组织DNA质量没有明显差异｡

紫外分光光度法检测结果见表3｡由表3可见,CTAB法提取的纤维成熟期韧皮组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm比值大于2,种子和根组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm分别为1.97和1.83,均介于1.8~2.0,总体最优｡SDS法和尿素法提取的3种组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm比值均小于1.8,说明含有蛋白质或者酚类物质,二者比较,尿素法稍好于SDS法｡3种组织比较,纤维成熟期韧皮组织的总DNA质量最好,种子和根组织的DNA质量差别不大｡

由表3可见,取等质量不同组织的材料,加入等量的提取缓冲液,CTAB法提取的DNA总量高于SDS法和尿素法提取的量,尿素法提取的种子和根组织的DNA总量高于SDS法提取的量,SDS法提取的纤维成熟期韧皮组织的DNA总量高于尿素法提取的量｡对比3种组织DNA提取量,种子>纤维成熟期韧皮组织>根组织｡

2.2不同研磨时间对组织DNA提取质量的影响

两种组织不同研磨时间提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳结果见图2｡由图2可见,CTAB法的条带较SDS法的条带更为清晰明亮｡不同研磨时间对纤维成熟期韧皮组织DNA质量无明显影响,对种子的DNA质量有较明显的影响,研磨时间越长提取的DNA质量越高｡

由表4可知,CTAB法提取的纤维成熟期韧皮组织DNA质量稍优于SDS法,而SDS法提取的DNA浓度远高于CTAB法｡从研磨时间来看,纤维成熟期韧皮组织研磨4 min提取的DNA(C2)质量最优,种子研磨6 min提取的DNA(S3)质量较好｡

3小结与讨论

对比不同方法提取的苎麻不同组织总DNA质量,CTAB法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳条带较为清晰,DNA质量最好,其次是SDS法,尿素法提取的DNA质量较差｡对比不同苎麻组织提取的总DNA质量,纤维成熟期韧皮组织中提取的DNA质量最好,种子和根组织提取的DNA质量差别不大｡对比不同组织提取的总DNA浓度,种子提取的DNA浓度最高,其次是韧皮组织和根组织,这可能与不同植物组织的细胞含量差异有关｡综上所述,用CTAB法提取的DNA质量最好,适用于提取苎麻基因组DNA｡

由于不同植物组织结构的差异,排除人为操作等外界因素,在提取总DNA过程中对研磨时间有不同的要求｡本研究表明韧皮组织研磨4 min,种子研磨6 min时,提取的DNA质量较好｡苎麻韧皮组织具有较高的纤维含量,研磨时间短导致细胞破裂不充分,影响DNA的得率,研磨时间过长,组织中所含的糖类等内含物会与DNA一起释放出来,影响DNA的质量｡种子由于细胞含量较多故较韧皮组织需要更长的研磨时间,其次较多的细胞数量也是种子DNA浓度较大的主要原因｡该研究结果为苎麻不同组织总DNA的提取和利用奠定了基础｡

参考文献:

[1] 喻春明,张彦红,朱爱国,等.苎麻种质资源纤维结晶度变异及其主要品质性状的关联分析[J].中国麻业科学,2011,33(5):223-231.

[2] 易庆平,罗正荣,张青林.植物总基因组DNA提取纯化方法综述[J].安徽农业科学,2007,35(25):7789-7791.

[3] 李艺,铁双贵,朱卫红,等.快速CTAB法提取玉米种子胚基因组DNA[J].河南农业科学,2008(2):17-20.

[4] 单志,吴宏亮,李成磊,等.改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究[J].广东农业科学,2011(8):113-115.

[5] 曹文波,郑璐璐,谢文海.一种提取植物基因组DNA的方法—改良尿素法[J].华中师范大学学报(自然科学版),2008,4(3):448-451.

[6] 张宁,王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物,2004(2):40-46.

[7] 郭新波,臧巩固,赵立宁,等.苎麻野生近缘种植物基因组DNA提取技术的改进[J].中国麻业科学,2008,30(1):28-32.

[8] 邱财生,程超华,赵立宁,等.用RAPD标记研究苎麻属植物的亲缘关系[J].湖北农业科学,2011,50(7):1499-1501.

[9] 侯思名,段继强,梁雪妮,等.苎麻总DNA提取的CTAB法优化方案[J].西北植物学报,2005,25(11):2193-2197.

[10] 黄小英,刘瑛,赖小萍,等.一种适提取野生苎麻总DNA的方法[J].中国野生植物资源,2002,21(1):56-57.

[11] 陈平,谭龙涛,喻春明,等.一种适用于PCR检测的苎麻陈麻原麻DNA提取方法[J].中国麻业科学,2012,34(6):249-251.

1.2.3尿素提取液称取0.048 g尿素,2.047 g NaCl,1.861 g EDTA溶于100 mL去离子水中,再加入5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),3 mL β-巯基乙醇,40 ℃水浴溶解｡

1.3苎麻DNA的提取

1.3.1试验设计方案试验设计方案及所提取DNA的编号见表1｡

1.3.2CTAB法

1)将1 g冰冻苎麻韧皮纤维组织放入盛有液氮的研钵中,用研杵将其磨成粉末,研磨过程不断添加液氮以保持组织冷冻｡

2)把组织粉末转移至Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL CTAB提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)待样品冷却至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液混匀,轻轻颠倒几次离心管使管内混合物成为乳浊液,常温下10 000 r/min离心10 min,取上清液转入另一干净离心管中｡

4)重复步骤3一次｡

5)取步骤4上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

6)弃去上层有机溶剂,加入500 μL 75 %乙醇洗涤沉淀,4 ℃下10 000 r/min离心5 min弃去上清,洗涤沉淀3次｡

7)倒置或者37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号C1､C2､C3｡

8)加入50 μL去离子水溶解DNA,于-20 ℃冷藏备用｡

1.3.3SDS法

1)同“1.3.2”中CTAB法步骤1｡

2)把粉末转移至Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL的SDS提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)再加入200 μL 5 mol/L KAC,冰浴20 min｡

4)同“1.3.2”中CTAB法步骤3｡

5)重复步骤4｡

6)取步骤5的上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

7)同“1.3.2”中CTAB法步骤6｡

8)倒置或者37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号S1､S2､S3｡

9)同1.3.2中CTAB法步骤8｡

1.3.4尿素法

1)同“1.3.2”中CTAB法步骤1｡

2)把粉末转移到Eppendorf管中,每1 g组织加3.0 mL的尿素提取液,用匀浆器充分研磨,转入离心管,于65 ℃水浴锅中保温约20 min(种子和根组织进行相同处理)｡

3)同“1.3.2”中CTAB法步骤3｡

4)重复步骤3一次｡

5)取步骤4上清液加入2.5倍体积无水乙醇,仔细混匀,于冰箱中-20 ℃冷藏30 min以上,沉淀DNA,再于4 ℃下12 000 r/min离心10 min｡

6)同“1.3.2”中CTAB法步骤6｡

7)倒置或者于37 ℃培养箱中烘干,3种DNA提取物分别标号N1､N2､N3｡

8)同“1.3.2”中CTAB法步骤8｡

1.4不同研磨时间对DNA提取质量的影响

本试验选用两种DNA提取液(CTAB和SDS提取液)对两种苎麻组织(纤维成熟期的韧皮组织､种子)进行不同研磨时间(2､4､6 min)的处理,操作方法及步骤同“1.3”中CTAB法和SDS法,比较研磨处理时间对提取出的DNA质量的影响｡试验设计及所提取的DNA编号见表2｡

1.5提取DNA的质量检测

1.5.1琼脂糖凝胶电泳法配制1.0%琼脂糖凝胶,苎麻总DNA上样量为5 μL,在0.5×TEB缓冲液中,电压100 V电泳15 min,在凝胶成像系统上观察并拍照｡

1.5.2紫外分光光度法取10 μL DNA,加TE溶液稀释200倍,测定DNA OD260 nm和OD280 nm,以检测DNA的浓度和纯度｡

2结果与分析

2.1不同方法对苎麻组织DNA提取质量的影响

同一组织不同方法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳对照结果见图1｡由图1可见,CTAB法提取的DNA条带最清晰,SDS法的DNA条带次之,尿素法的条带最模糊｡3种方法提取的纤维成熟期韧皮组织的DNA质量均比其他两种组织提取的DNA质量好,其中SDS法优于CTAB法和尿素法,CTAB法提取的种子DNA质量优于其他两种方法,3种方法提取的根组织DNA质量没有明显差异｡

紫外分光光度法检测结果见表3｡由表3可见,CTAB法提取的纤维成熟期韧皮组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm比值大于2,种子和根组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm分别为1.97和1.83,均介于1.8~2.0,总体最优｡SDS法和尿素法提取的3种组织总DNA的OD260 nm/OD280 nm比值均小于1.8,说明含有蛋白质或者酚类物质,二者比较,尿素法稍好于SDS法｡3种组织比较,纤维成熟期韧皮组织的总DNA质量最好,种子和根组织的DNA质量差别不大｡

由表3可见,取等质量不同组织的材料,加入等量的提取缓冲液,CTAB法提取的DNA总量高于SDS法和尿素法提取的量,尿素法提取的种子和根组织的DNA总量高于SDS法提取的量,SDS法提取的纤维成熟期韧皮组织的DNA总量高于尿素法提取的量｡对比3种组织DNA提取量,种子>纤维成熟期韧皮组织>根组织｡

2.2不同研磨时间对组织DNA提取质量的影响

两种组织不同研磨时间提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳结果见图2｡由图2可见,CTAB法的条带较SDS法的条带更为清晰明亮｡不同研磨时间对纤维成熟期韧皮组织DNA质量无明显影响,对种子的DNA质量有较明显的影响,研磨时间越长提取的DNA质量越高｡

由表4可知,CTAB法提取的纤维成熟期韧皮组织DNA质量稍优于SDS法,而SDS法提取的DNA浓度远高于CTAB法｡从研磨时间来看,纤维成熟期韧皮组织研磨4 min提取的DNA(C2)质量最优,种子研磨6 min提取的DNA(S3)质量较好｡

3小结与讨论

对比不同方法提取的苎麻不同组织总DNA质量,CTAB法提取的DNA琼脂糖凝胶电泳条带较为清晰,DNA质量最好,其次是SDS法,尿素法提取的DNA质量较差｡对比不同苎麻组织提取的总DNA质量,纤维成熟期韧皮组织中提取的DNA质量最好,种子和根组织提取的DNA质量差别不大｡对比不同组织提取的总DNA浓度,种子提取的DNA浓度最高,其次是韧皮组织和根组织,这可能与不同植物组织的细胞含量差异有关｡综上所述,用CTAB法提取的DNA质量最好,适用于提取苎麻基因组DNA｡

由于不同植物组织结构的差异,排除人为操作等外界因素,在提取总DNA过程中对研磨时间有不同的要求｡本研究表明韧皮组织研磨4 min,种子研磨6 min时,提取的DNA质量较好｡苎麻韧皮组织具有较高的纤维含量,研磨时间短导致细胞破裂不充分,影响DNA的得率,研磨时间过长,组织中所含的糖类等内含物会与DNA一起释放出来,影响DNA的质量｡种子由于细胞含量较多故较韧皮组织需要更长的研磨时间,其次较多的细胞数量也是种子DNA浓度较大的主要原因｡该研究结果为苎麻不同组织总DNA的提取和利用奠定了基础｡

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