胃癌患者血清MMP-9、NGAL水平及其临床意义

徐 希 陈卫昌 朱一凡 钱夷婷

苏州大学附属第一医院消化内科(215006)

基质金属蛋白酶(MMPs)家族是一组具有降解和重塑细胞外基质(ECM)功能的蛋白酶类，被认为与肿瘤细胞的生长、分化、侵袭、转移等生物学行为密切相关[1-2]。MMP-9属于明胶酶类，又名明胶酶B(gelatinase B)，是MMPs家族的重要成员。而中性粒细 胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)是在研究MMP-9时发现的小分子蛋白，是脂质运载蛋白(lipocalin)家族的新成员，可与MMP-9结合形成复合物，阻止MMP-9降解以维持其酶活性[3]。既往研究显示MMP-9过表达与多种恶性肿瘤的进展、转移密切相关[4-5]。本研究采用ELISA方法检测胃癌患者的血清MMP-9、NGAL水平，旨在初步探讨两者在胃癌患者外周血中的变化及其临床意义。

对象与方法

一、研究对象

选择2012年5月-2013年5月在苏州大学附属第一医院就诊的胃癌患者76例，其中男56例，女20例，年龄32～88岁，平均(62.89±9.55)岁。入选患者胃癌诊断经胃镜活检或手术病理证实，均为初治患者，之前未接受过放化疗以及其他抗肿瘤治疗，均签署知情同意书。其中65例患者接受手术治疗，临床和病理资料完整，术后病理均为腺癌，分期采用2010年UICC/AJCC胃癌TNM分期标准。另选取同期健康体检者50名作为正常对照组，其中男34例，女16例，年龄34～72岁，平均(55.27±12.03)岁，无心、肺、肝、肾等重要脏器疾病，无系统性炎症性疾病，无全身急慢性感染性疾病，肝肾功能正常。研究方案经医院伦理委员会批准。胃癌组与正常对照组间性别构成、年龄差异无统计学意义。

二、方法

抽取受试者清晨空腹外周静脉血5 mL，EDTA抗凝，室温静置1 h，4 360×g离心5 min，小心吸取上层血清，置于干燥洁净冻存管中，-80 ℃保存待测。MMP-9、NGAL浓度检测采用ELISA方法，试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，严格按试剂盒说明书进行操作，于酶标仪450 nm波长处读取吸光度值，绘制标准曲线，计算血清MMP-9、NGAL浓度。

三、统计学分析

结 果

一、血清MMP-9、NGAL水平及其与胃癌临床病理参数的关系

胃癌组血清MMP-9、NGAL水平均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(表1)。进一步分析65例接受手术治疗者的血清MMP-9、NGAL水平与胃癌临床病理参数的关系，发现不同TNM分期胃癌患者间的MMP-9、NGAL水平总体差异有统计学意义，其中Ⅰ+Ⅱ期MMP-9水平显著低于Ⅲ期和Ⅳ期(P=0.002,P=0.026)，Ⅲ、Ⅳ期间差异无统计学意义(P=0.852)；Ⅳ期NGAL水平显著高于Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ期(P=0.005,P=0.012)，Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ期间差异无统计学意义(P=0.495)。此外，有淋巴结转移者、肿瘤浸润突破浆膜层者血清MMP-9水平分别显著高于无淋巴结转移者和未突破浆膜层者，有远处转移者血清NGAL水平显著高于无远处转移者。肿瘤分化程度与血清MMP-9、NGAL水平均无关(表2)。

表1 两组血清MMP-9、NGAL水平比较

二、相关性分析

相关性分析显示，胃癌患者的血清MMP-9、NGAL水平均与肿瘤TNM分期呈显著正相关(P=0.010,rs=0.318;P=0.008,rs=0.328)，血清MMP-9与NGAL水平之间则无显著相关关系(P=0.235,r=0.138)。

三、血清MMP-9、NGAL筛查胃癌的诊断性能

绘制血清MMP-9、NGAL筛查胃癌的ROC曲线(图1)，两者曲线下面积(AUC)分别为0.832和0.942。MMP-9的最佳临界值为608.19 ng/mL，相应敏感性和特异性分别为64.5%和90.0%；NGAL的最佳临界值为14.71 ng/mL，相应敏感性和特异性分别为85.5%和90.0%。如采用并联试验，两者联合检测的敏感性和特异性分别为 94.7%和82.0%。

讨 论

胃癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发生、发展是多种因素共同作用的复杂过程。侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征，也是患者死亡的主要原因。肿瘤细胞突破基底膜是肿瘤转移的关键步骤，因此肿瘤细胞必须具备降解ECM的能力， 才能向周围组织浸润并侵入血管、 淋巴管向远处转移，MMPs家族成员通过介导ECM降解，在此步骤中起至关重要的作用[1-2]。MMP-9由Sopata和Dancewicz于1974年在中性粒细胞中发现，其能降解Ⅳ、Ⅴ型胶原和Ⅰ、Ⅴ型明胶，破坏基底膜完整性，在肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用，MMP-9过表达已被证实与乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的进展、转移密切相关[4-5]。此外，MMP-9尚可参与肿瘤血管生成，其机制与降解血管基底膜和周围间质以及血管内皮生长因子(VEGF)的合成和释放有关[6]。

表2 胃癌患者血清MMP-9、NGAL水平与临床病理参数的关系

图1 血清MMP-9、NGAL筛查胃癌的ROC曲线

本研究发现胃癌患者的血清MMP-9水平显著高于健康人，其中有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者，肿瘤浸润突破浆膜层者显著高于未突破浆膜层者，晚期胃癌(Ⅲ、Ⅳ期)显著高于早期胃癌(Ⅰ、Ⅱ期)。Kabashima等[7]发现癌组织MMP-9表达与黏膜内胃癌的淋巴结转移和淋巴管弥散显著相关；Torii等[8]发现胃癌患者术前血浆MMP-9水平显著增高并与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和pTNM分期密切相关，术后MMP-9水平显著降低；Sier等[9]的研究则提示胃癌组织中MMP-9高表达与预后不良相关，可作为胃癌预后的独立预测指标。综合本研究以及上述研究结果，血清MMP-9水平与癌组织MMP-9表达一样可反映胃癌的侵袭、进展和转移，是值得重视的胃癌监测指标。

MMPs/TIMPs(MMPs组织抑制剂)是维持ECM动态平衡的重要环节，决定了ECM的降解程度，两者活性失衡可促进恶性肿瘤浸润和转移。NGAL是Kjeldsen等[10]在1993年分离、纯化得到的与人MMP-9结合的蛋白，相对分子质量为25 kDa(1 Da=0.992 1 u)，可拮抗TIMP-1对MMP-9的抑制作用以维持其活性，促进ECM降解。在肿瘤细胞微环境中，最早出现的变化是上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，研究[11]表明NGAL可通过EMT关键转录因子Slug诱导EMT，进而促进某些肿瘤细胞(如人乳腺癌细胞)迁移和侵袭，参与肿瘤进展。而在另一些肿瘤细胞中(如4T1-Ras-转化肿瘤细胞)，NGAL则可逆转EMT(即诱导间质-上皮转化)，表现为抑制肿瘤细胞侵袭和转移[12]。在高转移性和低转移性结肠癌细胞株中，NGAL表达与细胞转移潜能呈负相关，在高转移性、低NGAL表达的结肠癌细胞株中过表达NGAL能显著抑制其侵袭和肝转移[13]。此外，NGAL在肿瘤组织中的表达有明显异质性，如在肺、结肠、胰腺癌中高表达，在肾、前列腺癌中低表达，淋巴和胸腺肿瘤不表达NGAL[14]。NGAL在不同类型肿瘤和细胞株中对侵袭、转移的不同影响可能与激活不同信号通路有关。

本研究发现胃癌患者的血清NGAL水平显著高于健康人，其中有远处转移者显著高于无远处转移者，且随TNM分期进展而增高，提示NGAL参与促进胃癌进展和转移。Kubben等[15]的研究显示胃癌组织中的MMP-9/NGAL复合物表达与Lauren分型、WHO分型和预后不良显著相关。上述结果提示检测胃癌患者的血清NGAL水平对胃癌的预后评估可能有一定价值。尽管NGAL与MMP-9在功能上存在一定联系，但本研究相关性分析却未提示胃癌患者中两者的血清水平存在相关关系，可能与不同胃癌患者的NGAL表达存在异质性有关。

由于多种恶性肿瘤患者均存在血清MMP-9、NGAL表达异常，故其检测对胃癌诊断缺乏特异性，但作为胃癌高危人群的筛查指标可能仍有一定价值。本研究应用ROC曲线评价了血清MMP-9、NGAL筛查胃癌的诊断性能，结果显示取最佳临界值时，两者的敏感性分别为64.5%和85.5%，特异性均为90.0%，如采用并联试验，敏感性可提高至94.7%，特异性则略有降低(82.0%)。鉴于血清MMP-9、NGAL水平均随胃癌TNM分期进展而增高，与TNM分期间存在显著正相关关系，故亦可考虑作为判断胃癌进展和预后的血清学指标。

综上所述，MMP-9、NGAL在胃癌侵袭和转移中发挥重要作用，两者在胃癌患者中的血清水平显著增高并与肿瘤进展相关，可能作为胃癌筛查、病情判断和预后评估的潜在指标。由于本研究样本量小、时间跨度短，研究结论尚需扩大样本量、完善随访并开展多中心临床试验以进一步验证。

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