日粮中纳豆芽孢杆菌对体外猪粪发酵液中臭气及微生物的影响

盛清凯，姜殿文，刘艳艳，窦红艳，宣玉娟，武 英

(1.山东省农科院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点试验室，山东 济南250100；2.山东省乐陵市畜牧兽医局，山东 乐陵 253600；3.山东省农科院生物技术研究中心，山东 济南250100)

日粮中纳豆芽孢杆菌对体外猪粪发酵液中臭气及微生物的影响

盛清凯1，姜殿文2，刘艳艳3，窦红艳1，宣玉娟1，武 英1

(1.山东省农科院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点试验室，山东 济南250100；2.山东省乐陵市畜牧兽医局，山东 乐陵 253600；3.山东省农科院生物技术研究中心，山东 济南250100)

为了减少舍外粪便污染，研究日粮中纳豆芽孢杆菌对体外猪粪发酵液中氨气、硫化氢、粪臭素及菌群的影响。试验组生猪饲喂纳豆芽孢杆菌日粮，对照组无纳豆芽孢杆菌。结果表明，试验组氨气、硫化氢、色氨酸、吲哚-3-乙酸、粪臭素浓度极显著低于对照组(P<0.01)，吲哚显著低于对照组(P<0.05)。对照组猪粪发酵液优势菌以芽孢杆菌(CWBI B1434)为主，含量为26%；试验组以非解乳糖链球菌(AF201899)为主，含量为36%，其次为噬淀粉乳酸杆菌，含量为16%。结果表明纳豆芽孢杆菌通过调整猪粪菌群降低臭味物质浓度。为了减少舍外粪便污染，建议猪日粮中添加纳豆芽孢杆菌。

猪粪；纳豆芽孢杆菌；氨气；硫化氢；粪臭素

猪粪尿污染已成为严重的社会公害，引起了人们的广泛关注。目前已发现猪粪尿中恶臭物质160多种，主要为氨气、硫化氢以及粪臭素等[1-2]。猪粪尿臭味物质来源于动物的粪尿。为了减少粪尿污染，人们常在日粮中添加乳酸菌等外源微生物及配制氨基酸平衡日粮等[3]。由于粪尿主要在舍外堆积过程中产生臭味物质，污染环境。受动物体内外环境的影响，调整日粮对舍外粪便臭味物质的产生常常无影响。

纳豆芽抱杆菌(BacillusNatto)对高温、酸性、胆盐和人工胃液有一定的耐受能力[4]。日粮中纳豆芽孢杆菌可以降低粪尿中氨气的浓度[5]，但对舍外粪便中硫化氢、粪臭素及菌群的影响尚不清楚。纳豆芽孢杆菌既可以添加到日粮中又可以在发酵床垫料中消纳粪污[6]。本试验旨在研究日粮中的纳豆芽孢杆菌对体外猪粪氨气、硫化氢、粪臭素及微生物的影响，为舍外粪便污染减排提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

80头体重为(50.0±0.5)kg的杜长大三元杂交商品猪。

1.2 试验设计

将80头猪随机分为对照组和试验组，每组4个重复，每重复10头猪。两组分别饲喂基础日粮及添加0.2%纳豆芽孢杆菌的试验日粮，均水泥地面饲养。纳豆芽孢杆菌含量为109CFU/g(山东华牧天元农牧股份公司提供)。6周后，对照组和试验组每组每个重复中随机选取1头猪，将该16头猪每头猪的新鲜粪便280 g悬浮在无菌厌氧的矿物质介质中(每升含NaHCO35.0 g，NaCl 0.9 g，(NH4)2SO40.9 g ，KH2PO40.45 g，K2HPO4.3H2O 0.45 g，CaC12.2H2O 0.03 g，MgCl20.02 g，MnSO4.4H2O 0.01 g，CoCl2.6H2O 0.01 g，FeSO4.7H2O 0.01 g，半胱氨酸浓度为10% 溶液1.0 mL)。将这种悬浮液随即转移到无菌充满CO2的塑料袋中，拍打5 min，后用6层灭菌纱布过滤以除去粗微粒物质。将10%(W/V) 粪水厌氧分别分装于150 mL无菌瓶中，每瓶3个重复，每瓶100 mL。38 ℃厌氧下分别培养24 h，然后从各瓶中各取出20 mL溶液，进行氨气、硫化氢、粪臭素及粪臭素相关指标的测定。将对照组和试验组的猪粪发酵液各自混匀，液氮冷冻保存，进行菌群分析。

1.3 臭味物质的测定

氨采用纳氏比色法测定；硫化氢采用碘量法测定；色氨酸、吲哚、吲哚-3-乙酸、粪臭素采用HPLC法[7]进行测定。

1.4 猪粪发酵液中菌群分析

提取DNA利用通用引物V3-340F、V3-532R扩增细菌16S rDNA V3区，利用荧光标记单链构象多态性及片段长度多态性(F-SSCP-FLP)技术进行PCR扩增，然后3730xl全自动分析仪进行毛细管电泳分离[8]，NCBI数据库进行Blast比对，确定发酵液中优势菌群的种类、含量及同源性。

1.5 数据处理

采用SAS(V9.1) 软件GLM(general linear models) 程序对所有数据进行处理,对照组和试验组数据比较采用t检验，P<0.01 为差异极显著,P<0.05 为差异显著。数据结果用平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌对猪粪臭味物质的影响

试验组中氨气、硫化氢、色氨酸、吲哚-3-乙酸及粪臭素浓度极显著低于对照组(P<0.01)，吲哚浓度显著低于对照组(P<0.05)，表明试验日粮中的纳豆芽孢杆菌可以减少猪粪发酵液中氨气、硫化氢及粪臭素的浓度(表1)。

2.2 发酵液优势菌群

对照组中优势菌为芽孢杆菌(CWBIB1434)，含量为26%。试验组中优势菌为非解乳糖链球菌(AF201899)，含量为36%；其次为噬淀粉乳杆菌。试验组中多检出芽孢杆菌(MA001)、噬淀粉乳酸杆菌。对照组和试验组优势菌种类及组成不同，表明发酵液中的菌群受日粮纳豆芽孢杆菌影响(表2)。

2.3 猪粪发酵液微生物同源性分析

图1和图2 相比，检出条带明显增多。图1 中芽孢杆菌CWBI B1434(C31-1-B11)与乳酸菌(C31-1-B1)同源性为31%。赖氨酸芽孢杆菌G10(C3/1-1-B2)与芽孢杆菌(B308-C31-1H7)同源性为100%。图2中增加了图1中未能培养的链球菌(T33147 V3R.)及未能培养的梭菌(T331E11V3R)。

表1 不同臭味物质的变化Table 1 Change of different odours in pig fermentation broths mg/L

注：同列肩注小写字母不同表示差异显著(P<0.05)；肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。

Notes: Values with different lowercase superscripts mean significant difference(P<0.05),different uppercase superscripts mean extreme difference(P<0.01).

表2 发酵液中的优势菌群Table 2 Dominant bacteria in fermentation broths

3 讨 论

养猪过程中产生的氨气、硫化氢、粪臭素等恶臭物质不仅严重影响了猪的生长发育，也使猪场附近居民受到危害。空气中的氨气污染是酸雨形成的重要原因之一，而畜禽生产已经成为全球最大的氨气污染来源。益生菌作为一种无毒、无残留、无抗药性的饲料添加剂，具有调节肠道菌群平衡、降低排泄物氨气散发量等诸多功能。为了改善养殖环境，日粮中常添加益生菌。纳豆芽孢杆菌作为一种益生菌，可添加于猪日粮中[9]，也可作为一种发酵床菌种使用[6]，减少氨的产生。本文中纳豆芽孢杆菌降低了猪粪发酵液氨气浓度，与杨锋[5]试验结果相似。氨的降低可能与纳豆芽孢杆菌分泌蛋白酶[10]及噬淀粉乳杆菌等菌群[11]改变相关。蛋白酶降解蛋白质，有利于氨的转化。噬淀粉乳杆菌在肠道分泌淀粉酶[12]、植酸酶[13]，也有利于氨的转化[14]。

图1 对照组猪粪发酵液微生物相似性分析Fig.1 Microbial similarity in control group pig manure fermentation broths

图2 试验组猪粪发酵液微生物相似性分析Fig.2 Microbial similarity in test group pig manure fermentation broths

本试验纳豆芽孢杆菌降低猪粪发酵液产硫化氢浓度，结论与Lee等[15-16]相似。纳豆芽孢杆菌降低硫化氢含量的机理可能在于芽孢杆菌群(M001)。Yumoto 等报道芽孢杆菌(M001)分泌物具有过氧化氢酶、氧化酶的活性，可以减少硫化氢的产生[17]。

本试验中试验组饲料添加芽孢杆菌，降低了猪粪发酵液中粪臭素的浓度，与色氨酸转化途径中微生物的改变影响粪臭素的形成[18-19]一致，差异之处可能在于影响的微生物菌不同。本试验中猪粪发酵液的优势菌为非解乳糖链球菌(AF201899)和噬淀粉乳杆菌。猪肠道中参与色氨酸转化成粪臭素的菌尚不完全清楚。目前报道的猪肠道中参与粪臭素降解的菌为：乳酸菌(11201)[20]、梭菌(drakeiiandskatologenesis[21]、disporicum[22]、ATCC 25775[23])。关于非解乳糖链球菌(AF201899)的功能，目前尚未见报道。Rinkinen 等[24]报道非解乳糖链球菌为狗空肠和粪便中产乳酸的优势菌，Vandanme等[25]报道非解乳糖链球菌分泌物具有β-糖苷酶、α-牛乳糖苷酶、淀粉酶、脲酶的活性，酸性物质来源于半乳糖、牛乳糖等物质。日粮中的乳酸可降低肠道中粪臭素的含量[26-27]。噬淀粉乳杆菌为一种有益菌[28]，分泌乳酸及淀粉酶[12]，在猪结肠中在半乳低聚糖和双歧杆菌的作用下促进生长[29]。目前尚未见噬淀粉乳杆菌直接降解粪臭素的报道。粪臭素在体外可被链球菌6020[30]及乳酸菌1.12[31]降解。本试验中非解乳糖链球菌(AF201899)、噬淀粉乳酸杆菌及芽孢杆菌(M001)的功能尚需进一步验证。

4 结 论

日粮中的纳豆芽孢杆菌通过影响猪粪发酵液中的菌群降低猪粪氨气、硫化氢及粪臭素的浓度。日粮中添加纳豆芽孢杆菌，有益于体外猪粪臭气的减少。

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EffectofBacillusNattoinDietonOdorsandMicrobesinPigManureFermentationBrothsinVitro

SHENG Qing-kai1,JIANG Dian-wen2,LIU Yan-yan3,DOU Hong-yan1,XUAN Yu-juan1,WU Ying1

(1.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicineofSAAS/ShandongProvincialKeyLaboratoryofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan，Shandong250100,China；2.LaolingCityBureauofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,Laoling,Shandong253600,China;3.BiotechnologyResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan，Shandong250100,China)

In order to reduce the pollution of pig manure outdoors,the study investigated the effect ofBacillusnattoin diet on ammonia,hydrogen sulfide,skatole and microbes in pig manure fermentation broths.The test group pigs intook diet with additionalBacillusnattoAnd the liquid manures were anaerobic fermented.When compared to the control group,contents of ammonia,hydrogen sulfide,Tryp,indole -3- acetic acid and skatole in test group lowered(P<0.01) and indole decreased(P<0.05).The Bacillus sp(CWBI B1434) was the predominate bacteria in control group with a content of 26%,the lactose Streptococcus(AF201899) predominated in the test group with a content of 36% andLactobacillusamylovorus16% secondly.The results showed thatBacillusnatto reduced odor contents by influencing the pig manure microbes.Supplementation ofBacillusnattoin diet was beneficial to reduce the pollution of pig manure outdoors.

pig manure；Bacillusnatto；ammonia；hydrogen sulfide；skatole

2014-04-16，

2014-06-17

国家自然基金(31172245)

盛清凯(1971-)，男，山东陵县人，博士，研究员，研究方向为单胃动物营养与环境科学。E-mail：qksheng@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)10-0036-05