1株桑枝分解真菌的筛选、酶学特性及降解能力

王娜　余晗

摘要：采用刚果红染色鉴定法，通过以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为碳源的分离培养基初筛和以桑枝粉为碳源的复筛培养基复筛，从桑园地边垛叠腐烂桑枝下土壤中筛选出1株产纤维素酶的真菌P1，并对其酶学性质和对桑枝的降解能力进行了初步研究。结果表明，P1能有效降解桑树枝条，最适生长pH值为6，最适生长温度为 32 ℃。产生的纤维素酶为复合酶系，具有滤纸酶（FPAase）、羧甲基纤维素酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶活性。FPAase在发酵4 d活性最高，可达10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出现活力高峰，达18.188 U/mL；CMCase活力变化相对平缓，4～10 d酶活力变化不大，保持在9～11 U/mL之间。FPAase和CMCase均有较好的温度和pH适应性，在 40～60 ℃ 和pH值4～6的范围内均有较好活性。以CMC-Na为底物时P1的最大反应速率（Vmax）和米氏常数（Km）分别为0.082 9 mg/（mL·min）和 0.554 5 mg/mL。基于形态学和18S rDNA序列鉴定P1为撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）。撕裂蜡孔菌是一种典型的木腐菌。该菌株有较好的酶活性和温度及pH适应性，能有效降解桑树枝条。

关键词：桑枝；真菌；酶学特性；降解

中图分类号： Q939.9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0378-03

收稿日期：2013-10-08

基金项目：江苏科技大学大学生科技创新计划。

作者简介：王娜（1976—），女，山东烟台人，硕士，副教授，主要从事生物活性物质开发和利用研究。 E-mail：biojustwn@126.com。纤维素是地球上最为丰富的可再生资源和碳水化合物，占植物界碳素总量的50%以上[1-2]。纤维素是一类线状大分子物质，由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成，由于高度的水不溶性且外围又被木质素包围，除反刍动物瘤胃中的微生物可降解转化少部分纤维素外，大部分纤维素很难降解为可利用的葡萄糖。栽桑养蚕、缫丝织绸是我国传统产业，作为产业物质基础的桑树（Morus alba L.）附属物桑枝由于高度木质纤维化，利用率极低，剪伐后的桑枝和其他纤维素类秸秆一样大多在田间地头焚烧，或堆积在地头任其自然腐烂，不仅浪费资源，对环境也有不同程度的破坏。虽然桑枝具有较高的营养、药用和工业价值[3-5]，在菌类养殖中[6-7]也得到了较好的应用，但利用率仅为10%左右。目前，通过微生物产纤维素酶降解纤维素是最经济环保的方法。纤维素酶是指把纤维素降解为纤维素二糖和葡萄糖等小分子可溶性物质的一组酶的总称，主要由3个主要成分组成[8]。自然界中细菌、真菌、放线菌等许多生物体中可产生纤维素酶[9]，已报道的酶菌种就有50多个属上千个菌株[10]，受到酶活性低等因素的限制。筛选活性高、抗逆性好的纤维素酶，已成为微生物学、环境保护科学、饲料酶制剂工业等多学科研究的热点。本试验采用刚果红染色法从桑园周围的土壤中分离得到1株具有产纤维素酶活性的菌株P1，通过形态学和18S rDNA分子生物学鉴定的方法，确定其为撕裂蜡孔菌；并对菌株降解桑枝过程中有关酶特性等进行了初步研究，为菌株应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

桑枝：春季剪伐时收集健壮生长良好的枝条，剪成5 cm左右小段，50～60 ℃烘箱中烘干，粉碎后过40目筛，备用。

桑园周围土壤：采自中国农业科学院蚕业研究所（江苏镇江），土壤取3处，分别为桑树根际土壤、桑园地边垛叠腐烂桑枝下土壤、桑地空隙处土壤。取距土壤表层10 cm左右深处，自然风干后研磨成粉，备用。

1.2培养基

分离培养基：CMC-Na 10 g、琼脂10 g、无机盐溶液 100 mL、水400 mL，pH值7。无机盐溶液（g/L）：MgSO4·7H2O 1.5、（NH4）2SO4 7、KH2PO4 10、CaCl2 1.5、MnSO4·H2O 8.95、FeSO4·7H2O 0.045 7、ZnCl2 0.008 5、CoCl2·6H2O 0018 3。

复筛培养基：桑枝粉50 g、麦麸皮2 g、琼脂8 g、无机盐溶液100 mL、水400 mL，pH值7。无机盐溶液（g/L）：NaNO3 25、KH2PO4 10、MnSO4·H2O 3、NaNO2 1、FeCl3 0.1。

发酵培养基：烘干的5 cm左右长度桑树枝条500 g，麦麸皮10 g，按照复筛培养基配方加入无机盐溶液200 mL，拌匀。

1.3仪器与试剂

仪器：9600型紫外可见分光光度计、DHZ-D恒温振荡摇床、SW-CJ-1F超净工作台、日本三洋高压灭菌锅、蔡司荧光显微镜等。试剂：均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司、上海生工生物工程技术服务有限公司；引物合成和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.4目的菌株的筛选

各取土壤样品10 g于灭菌三角瓶中，加入100 mL无菌水，封口后在100 r/min的转速下振荡0.5 h。取100 μL该悬浮液均匀涂布在分离培养基上，37 ℃下恒温培养24 h，样品重复3次。将长出的单菌落菌株挑出继续接种在固体分离培养基上培养，重复多次后得纯化菌株。将纯化菌株点接在分离培养基上24 h，采用刚果红染色鉴定法[11]染色10～15 min，1 mol/L NaCl溶液洗涤15 min，观察菌落周围有无透明圈。若有透明圈则初步证明该菌株具有产纤维素酶的能力，透明圈越大，产酶能力越强。挑选透明圈较大的菌株接种在固体复筛培养基上，37 ℃下恒温培养，观察菌株生长情况。挑选能有效以桑枝粉为碳源的菌株进行系列研究。

1.5粗酶液的制备endprint

取1 L三角瓶，装入300 mL液态复筛培养基（pH值60），灭菌后接入菌株，于32 ℃、110 r/min摇床振荡培养。定时定点取样，发酵液在4 ℃、10 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液。

1.6酶活力测定

滤纸酶（FPAase）活力测定参照李振江等的方法[12]，以粉碎的新华滤纸为底物；羧甲基纤维素酶（CMCase）活力测定参照Agnihotri等的方法[13]，以CMC-Na为底物；β-葡萄糖苷酶活力测定参照周津等的方法[14]，以水杨酸苷为底物。以 1 min 由底物生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

1.7酶学特性研究

1.7.1反应最适温度将粗酶液在20、30、40、50、60 ℃的不同温度条件下，在pH值为4.5 的0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液中反应1 h，按照FPAase和CMCase的方法测定酶活力。

1.7.2反应最适pH值分别设置0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液的pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在最适温度下反应 1 h，按照FPAase和CMCase的方法测定酶活力。

1.7.3CMCase酶学动力学调节底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）浓度（[S]）分别为2、3、4、5、6 mg/mL，按 CMCase 活力测定方法测定酶促反应速率[v，mg/（mL·min）]。用双倒数法作图，以底物浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，酶反应速率的倒数（1/v）为纵坐标，计算出米氏常数（Km）及最大催化反应速率（vmax）[15]。

3结论

本试验通过刚果红透明圈法和纤维素酶活性的测定，从桑园土壤中筛选出1株较为理想的降解桑枝的菌株P1，在桑树枝粉为主要碳源的固体复筛培养基中，菌株能较好生长。P1为酸性菌，最适生长温度在32 ℃，最适生长pH值为6。

对该菌纤维素酶活性分析结果表明，该菌产生的纤维素酶属于复合酶系。在不同发酵时间对酶系中的3种酶活力测定结果：P1的滤纸酶活力在4 d时活性最高，可达到10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出现活力高峰，达到 18.188 U/mL；而CMCase活力变化相对平缓，4～10 d酶活力变化不大。P1产生的FPAase和CMCase均有较好的温度和pH值适应范围。以CMC-Na为底物，采用双倒数作图法计算获得P1的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为0.082 9 mg/（mL·min）和0.554 5 mg/mL。

P1降解桑树枝的能力相对较弱，酶活力较低，但其产纤维素酶具有酶促反应条件温和、范围广等优良性质，有望通过对其基因诱变提高产酶能力。

通过形态学和18S rDNA鉴定，确定P1为撕裂蜡孔菌。发酵试验表明，菌株P1能够很好地利用桑枝条，在桑枝条上长出子实体，使桑枝条腐烂变黑。参考文献：

[1]Lynd L R，Weimer P J，van Zyl W H，et al. Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66（3）：506-577.

[2]张平平，刘宪华. 纤维素生物降解的研究现状与进展[J]. 天津农学院学报，2004，11（3）：48-54.

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[4]黄盖群，邬谨，刘刚，等. 桑树的药用价值及其开发应用[J]. 蚕学通讯，2007，27（4）：41-43.

[5]牛建设，喻红芹，张之亮.桑皮纤维性能与开发利用现状的研究[J]. 上海纺织科技，2008，36（6）：19-20.

[6]陆娜，闫静，周祖法，等. 桑枝屑栽培猴头菇栽培模式试验[J]. 食用菌，2012（4）：37-38.

[7]姚利娟. 桑枝秀珍菇反季节高效栽培技术[J]. 蚕桑通报，2012，43（3）：56-57.

[8]燕红，杨谦，王希国. 两株芽孢杆菌产纤维素酶的研究[J]. 林产化学与工业，2006，26（2）：83-86.

[9]谢占玲，吴润. 纤维素酶的研究进展[J]. 草业科学，2004，21（4）：72-76.

[10]王颖. 纤维素酶产生菌的筛选[J]. 牡丹江医学院学报，2009，30（4）：90-92.

[11]沈雪亮，夏黎明. 产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究[J]. 林产化学与工业，2002，22（1）：47-51.

[12]李振红，陆贻通. 高效纤维素降解菌的筛选[J]. 环境污染与防治，2003，25（3）：133-135，153.

[13]Agnihotri S，Dutt D，Tyagi C H，et al. Production and biochemical characterization of a novel cellulose-poor alkali-thermo-tolerant xylanase from Coprinellus disseminatus SW-1NTCC 1165[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2010，26（8）：1349-1359.

[14]周津，阮宏，孙连魁. 绿色木霉A10纤维素酶的分离纯化及理化性质研究[J]. 西北大学学报：自然科学版，1994，24（5）：465-469.

[15]王镜岩，朱圣庚，徐长发. 生物化学：下册 [M].3版. 北京：高等教育出版社，2002：355-367.

[16]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：367-378.endprint

取1 L三角瓶，装入300 mL液态复筛培养基（pH值60），灭菌后接入菌株，于32 ℃、110 r/min摇床振荡培养。定时定点取样，发酵液在4 ℃、10 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液。

1.6酶活力测定

滤纸酶（FPAase）活力测定参照李振江等的方法[12]，以粉碎的新华滤纸为底物；羧甲基纤维素酶（CMCase）活力测定参照Agnihotri等的方法[13]，以CMC-Na为底物；β-葡萄糖苷酶活力测定参照周津等的方法[14]，以水杨酸苷为底物。以 1 min 由底物生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

1.7酶学特性研究

1.7.1反应最适温度将粗酶液在20、30、40、50、60 ℃的不同温度条件下，在pH值为4.5 的0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液中反应1 h，按照FPAase和CMCase的方法测定酶活力。

1.7.2反应最适pH值分别设置0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液的pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在最适温度下反应 1 h，按照FPAase和CMCase的方法测定酶活力。

1.7.3CMCase酶学动力学调节底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）浓度（[S]）分别为2、3、4、5、6 mg/mL，按 CMCase 活力测定方法测定酶促反应速率[v，mg/（mL·min）]。用双倒数法作图，以底物浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，酶反应速率的倒数（1/v）为纵坐标，计算出米氏常数（Km）及最大催化反应速率（vmax）[15]。

3结论

本试验通过刚果红透明圈法和纤维素酶活性的测定，从桑园土壤中筛选出1株较为理想的降解桑枝的菌株P1，在桑树枝粉为主要碳源的固体复筛培养基中，菌株能较好生长。P1为酸性菌，最适生长温度在32 ℃，最适生长pH值为6。

对该菌纤维素酶活性分析结果表明，该菌产生的纤维素酶属于复合酶系。在不同发酵时间对酶系中的3种酶活力测定结果：P1的滤纸酶活力在4 d时活性最高，可达到10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出现活力高峰，达到 18.188 U/mL；而CMCase活力变化相对平缓，4～10 d酶活力变化不大。P1产生的FPAase和CMCase均有较好的温度和pH值适应范围。以CMC-Na为底物，采用双倒数作图法计算获得P1的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为0.082 9 mg/（mL·min）和0.554 5 mg/mL。

P1降解桑树枝的能力相对较弱，酶活力较低，但其产纤维素酶具有酶促反应条件温和、范围广等优良性质，有望通过对其基因诱变提高产酶能力。

通过形态学和18S rDNA鉴定，确定P1为撕裂蜡孔菌。发酵试验表明，菌株P1能够很好地利用桑枝条，在桑枝条上长出子实体，使桑枝条腐烂变黑。参考文献：

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[15]王镜岩，朱圣庚，徐长发. 生物化学：下册 [M].3版. 北京：高等教育出版社，2002：355-367.

[16]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：367-378.endprint

取1 L三角瓶，装入300 mL液态复筛培养基（pH值60），灭菌后接入菌株，于32 ℃、110 r/min摇床振荡培养。定时定点取样，发酵液在4 ℃、10 000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液。

1.6酶活力测定

滤纸酶（FPAase）活力测定参照李振江等的方法[12]，以粉碎的新华滤纸为底物；羧甲基纤维素酶（CMCase）活力测定参照Agnihotri等的方法[13]，以CMC-Na为底物；β-葡萄糖苷酶活力测定参照周津等的方法[14]，以水杨酸苷为底物。以 1 min 由底物生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

1.7酶学特性研究

1.7.1反应最适温度将粗酶液在20、30、40、50、60 ℃的不同温度条件下，在pH值为4.5 的0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液中反应1 h，按照FPAase和CMCase的方法测定酶活力。

1.7.2反应最适pH值分别设置0.05 mol/L的柠檬酸缓冲液的pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在最适温度下反应 1 h，按照FPAase和CMCase的方法测定酶活力。

1.7.3CMCase酶学动力学调节底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）浓度（[S]）分别为2、3、4、5、6 mg/mL，按 CMCase 活力测定方法测定酶促反应速率[v，mg/（mL·min）]。用双倒数法作图，以底物浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，酶反应速率的倒数（1/v）为纵坐标，计算出米氏常数（Km）及最大催化反应速率（vmax）[15]。

3结论

本试验通过刚果红透明圈法和纤维素酶活性的测定，从桑园土壤中筛选出1株较为理想的降解桑枝的菌株P1，在桑树枝粉为主要碳源的固体复筛培养基中，菌株能较好生长。P1为酸性菌，最适生长温度在32 ℃，最适生长pH值为6。

对该菌纤维素酶活性分析结果表明，该菌产生的纤维素酶属于复合酶系。在不同发酵时间对酶系中的3种酶活力测定结果：P1的滤纸酶活力在4 d时活性最高，可达到10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出现活力高峰，达到 18.188 U/mL；而CMCase活力变化相对平缓，4～10 d酶活力变化不大。P1产生的FPAase和CMCase均有较好的温度和pH值适应范围。以CMC-Na为底物，采用双倒数作图法计算获得P1的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为0.082 9 mg/（mL·min）和0.554 5 mg/mL。

P1降解桑树枝的能力相对较弱，酶活力较低，但其产纤维素酶具有酶促反应条件温和、范围广等优良性质，有望通过对其基因诱变提高产酶能力。

通过形态学和18S rDNA鉴定，确定P1为撕裂蜡孔菌。发酵试验表明，菌株P1能够很好地利用桑枝条，在桑枝条上长出子实体，使桑枝条腐烂变黑。参考文献：

[1]Lynd L R，Weimer P J，van Zyl W H，et al. Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66（3）：506-577.

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[4]黄盖群，邬谨，刘刚，等. 桑树的药用价值及其开发应用[J]. 蚕学通讯，2007，27（4）：41-43.

[5]牛建设，喻红芹，张之亮.桑皮纤维性能与开发利用现状的研究[J]. 上海纺织科技，2008，36（6）：19-20.

[6]陆娜，闫静，周祖法，等. 桑枝屑栽培猴头菇栽培模式试验[J]. 食用菌，2012（4）：37-38.

[7]姚利娟. 桑枝秀珍菇反季节高效栽培技术[J]. 蚕桑通报，2012，43（3）：56-57.

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[9]谢占玲，吴润. 纤维素酶的研究进展[J]. 草业科学，2004，21（4）：72-76.

[10]王颖. 纤维素酶产生菌的筛选[J]. 牡丹江医学院学报，2009，30（4）：90-92.

[11]沈雪亮，夏黎明. 产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究[J]. 林产化学与工业，2002，22（1）：47-51.

[12]李振红，陆贻通. 高效纤维素降解菌的筛选[J]. 环境污染与防治，2003，25（3）：133-135，153.

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