RP—HPLC测定茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量

邹盛勤　姜琼

摘要：建立了测定茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的反相高效液相色谱分析方法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）。样品经超声提取后，利用Kromasil C18色谱柱分离，流动相为乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL），流速0.8 mL/min，检测波长278 nm，柱温30 ℃。没食子酸进样量在0.066～1.650 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为97.1%，RSD为1.1%（n=6）；儿茶素进样量在0.240～6.000 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 6），平均回收率为 97.5%，RSD为1.5%（n=6）；表儿茶素进样量在0.252～6.300 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 7），平均回收率为 96.9%，RSD为12%（n=6）。试验结果表明，建立的方法操作简便、数据精确，可用于茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量测定。

关键词：茶叶；没食子酸；儿茶素；表儿茶素；RP-HPLC

中图分类号： TS272.7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0322-02

收稿日期：2013-10-28

作者简介：邹盛勤（1970—），男，江西奉新人，硕士，教授，从事天然产物活性成分的提取与分析研究。E-mail：zsqycxy@163.com。

通信作者：姜琼，男，湖北潜江人，硕士，讲师，从事天然产物开发与研究。E-mail：qqj2000@163.com。茶叶为山茶科山茶属植物茶（Camellia sinensis）的芽叶。茶叶一名始载于《名医别录》，“世医治暑病，以茶叶饮为首药”[1]。茶叶全草可作药用，性微温，具有发汗解暑、行水散湿、温胃调中、利水消肿的功效[2]。我国拥有丰富的茶叶资源和数千年的茶文化历史。茶叶中具有多种活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶皂素、可可碱、咖啡碱、挥发油、氨基酸等，其中多酚类化合物主要由没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等30多种化学物质组成[3]，具有调血脂、降血糖、抗肿瘤、抗衰老、美容减肥等药理作用[3-5]。茶多酚的定量方法主要有高效液相色谱法和毛细管电泳法等[6-9]。茶叶化学成分的研究报道较多，但同时测定茶叶样品中没食子酸、儿茶素和表儿茶素含量的方法尚未见报道。本试验建立反相高效液相色谱法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）同时测定浙产茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量，旨在为茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的定量分析及其药效基础物质的研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

没食子酸、表儿茶素和儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为：110831-200302、110877-200916、110831-200911），乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。084龙井、龙井、白茶、越剑茶和浙农113茶叶品种均购自浙江省，经鉴定为茶（C. sinensis）的芽叶。

Waters高效液相色谱仪（515泵，2996光电二极管阵列检测器，Empower中文色谱工作站，美国）；RO-MB-10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP225D电子分析天平（德国Sartourius公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK2510HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率：250W，频率：59 kHz）。

1.2溶液配制

1.2.1对照品溶液分别精确称取1.32、4.80、5.04 mg没食子酸、儿茶素和表儿茶素对照品，置于20 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解后，稀释至刻度，摇匀后配制成含0.066 mg/mL没食子酸、0.240 mg/mL儿茶素和0.252 mg/mL表儿茶素的对照品混合溶液。

1.2.2 样品溶液茶叶样品于恒温干燥箱中80 ℃下干燥 6 h，高速粉碎机粉碎。分别精确称取2 g各茶叶样品粉末，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入50 mL 95%乙醇后称重；超声提取45 min，冷却后用甲醇补足损失重量，摇匀后用 0.45 μm 滤膜过滤，取过滤液作为样品溶液。

1.3检测波长的选择

对照品溶液采用光电二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描，选择合适的检测波长。

1.4色谱条件

色谱柱为Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL）；流速 0.8 mL/min；检测波长278 nm；柱温为30 ℃。

1.5精密度试验

分别精确吸取10 μL含没食子酸、儿茶素和表儿茶素的对照品混合溶液，平行进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度。

1.6重现性试验

取5份茶叶样品，每份约2 g，按“1.2.2项”中样品溶液制备方法制备样品溶液。精确吸取样品溶液各10 μL，分别进样，测定其峰面积积分值，用外标法计算含量。

1.7加样回收率试验

精确称取6份已知没食子酸、儿茶素、表儿茶素含量的茶叶样品，每份约1 g，按高、中、低3种浓度分别加入适量对照品制备样品溶液，进样测定含量。

1.8线性关系试验

用微量注射器精确吸取1、7、13、20、25 μL含没食子酸、儿茶素和表儿茶素的对照品混合贮备液，进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标（μg），峰面积为纵坐标（μV·s）。

1.9样品含量测定

精确吸取制备的样品溶液各10 μL，平行进样3次，测定没食子酸、儿茶素和表儿茶素峰面积积分值，外标法计算平均含量。

2结果与分析

2.1检测波长

试验测得对照品溶液中没食子酸最大吸收波长为2163、271.7 nm，儿茶素最大吸收波长为203.4、278.8 nm，表儿茶素最大吸收波长为203.4、278.8 nm（图1）。因此选择278.0 nm作为检测波长，此波长下没食子酸、儿茶素和表儿茶素均有较强的紫外吸收，信噪比高，基线平稳。

参考文献：

[1]宋立人，洪恂，丁绪亮，等. 现代中药学大辞典：下册[M]. 北京：人民卫生出版社，2001：1489-1492.

[2]张国民，李平忠，孙晶. 茶叶化学成分及研究现状[J]. 农业与技术，2012，32（5）：226-226，230.

[3]姜守刚，蒋建勤，王建营，等. 茶多酚的提取分离和分析鉴定研究[J]. 药学进展，2005，29（2）：72-77.

[4]刘作春，李玉山. 恩施绿茶多糖对糖尿病模型大鼠血糖的影响[J]. 现代预防医学，2009，36（7）：1234-1235.

[5]陈建国，江月仙，来伟旗，等. 茶多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠调节血糖及其抗氧化作用的探讨[J]. 毒理学杂志，2009，23（4）：299-301.

[6]孙志栋，顾富强，梁月荣，等. 茶多酚提取优化工艺研究[J]. 天然产物研究与开发，2007（19）：490-493.

[7]康海宁，陈波，韩超，等. HPLC法测定茶叶水提液中五种儿茶素和咖啡碱及其用于茶叶分类的研究[J]. 分析测试学报，2007，26（2）：211-215，220.

[8]朱旗，Clifford M N，毛清黎，等. LC-MS分析普洱茶和茯砖茶与红茶成分的比较研究[J]. 茶叶科学，2006，26（3）：191-194.

[9]张国民，廖予琦，王庆忠. HPLC内标标准曲线法测定茶叶中4种儿茶素和咖啡因[J]. 昆明学院学报，2010，32（3）：47-50.endprint

摘要：建立了测定茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的反相高效液相色谱分析方法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）。样品经超声提取后，利用Kromasil C18色谱柱分离，流动相为乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL），流速0.8 mL/min，检测波长278 nm，柱温30 ℃。没食子酸进样量在0.066～1.650 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为97.1%，RSD为1.1%（n=6）；儿茶素进样量在0.240～6.000 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 6），平均回收率为 97.5%，RSD为1.5%（n=6）；表儿茶素进样量在0.252～6.300 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 7），平均回收率为 96.9%，RSD为12%（n=6）。试验结果表明，建立的方法操作简便、数据精确，可用于茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量测定。

关键词：茶叶；没食子酸；儿茶素；表儿茶素；RP-HPLC

中图分类号： TS272.7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0322-02

收稿日期：2013-10-28

作者简介：邹盛勤（1970—），男，江西奉新人，硕士，教授，从事天然产物活性成分的提取与分析研究。E-mail：zsqycxy@163.com。

通信作者：姜琼，男，湖北潜江人，硕士，讲师，从事天然产物开发与研究。E-mail：qqj2000@163.com。茶叶为山茶科山茶属植物茶（Camellia sinensis）的芽叶。茶叶一名始载于《名医别录》，“世医治暑病，以茶叶饮为首药”[1]。茶叶全草可作药用，性微温，具有发汗解暑、行水散湿、温胃调中、利水消肿的功效[2]。我国拥有丰富的茶叶资源和数千年的茶文化历史。茶叶中具有多种活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶皂素、可可碱、咖啡碱、挥发油、氨基酸等，其中多酚类化合物主要由没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等30多种化学物质组成[3]，具有调血脂、降血糖、抗肿瘤、抗衰老、美容减肥等药理作用[3-5]。茶多酚的定量方法主要有高效液相色谱法和毛细管电泳法等[6-9]。茶叶化学成分的研究报道较多，但同时测定茶叶样品中没食子酸、儿茶素和表儿茶素含量的方法尚未见报道。本试验建立反相高效液相色谱法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）同时测定浙产茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量，旨在为茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的定量分析及其药效基础物质的研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

没食子酸、表儿茶素和儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为：110831-200302、110877-200916、110831-200911），乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。084龙井、龙井、白茶、越剑茶和浙农113茶叶品种均购自浙江省，经鉴定为茶（C. sinensis）的芽叶。

Waters高效液相色谱仪（515泵，2996光电二极管阵列检测器，Empower中文色谱工作站，美国）；RO-MB-10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP225D电子分析天平（德国Sartourius公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK2510HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率：250W，频率：59 kHz）。

1.2溶液配制

1.2.1对照品溶液分别精确称取1.32、4.80、5.04 mg没食子酸、儿茶素和表儿茶素对照品，置于20 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解后，稀释至刻度，摇匀后配制成含0.066 mg/mL没食子酸、0.240 mg/mL儿茶素和0.252 mg/mL表儿茶素的对照品混合溶液。

1.2.2 样品溶液茶叶样品于恒温干燥箱中80 ℃下干燥 6 h，高速粉碎机粉碎。分别精确称取2 g各茶叶样品粉末，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入50 mL 95%乙醇后称重；超声提取45 min，冷却后用甲醇补足损失重量，摇匀后用 0.45 μm 滤膜过滤，取过滤液作为样品溶液。

1.3检测波长的选择

对照品溶液采用光电二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描，选择合适的检测波长。

1.4色谱条件

色谱柱为Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL）；流速 0.8 mL/min；检测波长278 nm；柱温为30 ℃。

1.5精密度试验

分别精确吸取10 μL含没食子酸、儿茶素和表儿茶素的对照品混合溶液，平行进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度。

1.6重现性试验

取5份茶叶样品，每份约2 g，按“1.2.2项”中样品溶液制备方法制备样品溶液。精确吸取样品溶液各10 μL，分别进样，测定其峰面积积分值，用外标法计算含量。

1.7加样回收率试验

精确称取6份已知没食子酸、儿茶素、表儿茶素含量的茶叶样品，每份约1 g，按高、中、低3种浓度分别加入适量对照品制备样品溶液，进样测定含量。

1.8线性关系试验

用微量注射器精确吸取1、7、13、20、25 μL含没食子酸、儿茶素和表儿茶素的对照品混合贮备液，进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标（μg），峰面积为纵坐标（μV·s）。

1.9样品含量测定

精确吸取制备的样品溶液各10 μL，平行进样3次，测定没食子酸、儿茶素和表儿茶素峰面积积分值，外标法计算平均含量。

2结果与分析

2.1检测波长

试验测得对照品溶液中没食子酸最大吸收波长为2163、271.7 nm，儿茶素最大吸收波长为203.4、278.8 nm，表儿茶素最大吸收波长为203.4、278.8 nm（图1）。因此选择278.0 nm作为检测波长，此波长下没食子酸、儿茶素和表儿茶素均有较强的紫外吸收，信噪比高，基线平稳。

参考文献：

[1]宋立人，洪恂，丁绪亮，等. 现代中药学大辞典：下册[M]. 北京：人民卫生出版社，2001：1489-1492.

[2]张国民，李平忠，孙晶. 茶叶化学成分及研究现状[J]. 农业与技术，2012，32（5）：226-226，230.

[3]姜守刚，蒋建勤，王建营，等. 茶多酚的提取分离和分析鉴定研究[J]. 药学进展，2005，29（2）：72-77.

[4]刘作春，李玉山. 恩施绿茶多糖对糖尿病模型大鼠血糖的影响[J]. 现代预防医学，2009，36（7）：1234-1235.

[5]陈建国，江月仙，来伟旗，等. 茶多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠调节血糖及其抗氧化作用的探讨[J]. 毒理学杂志，2009，23（4）：299-301.

[6]孙志栋，顾富强，梁月荣，等. 茶多酚提取优化工艺研究[J]. 天然产物研究与开发，2007（19）：490-493.

[7]康海宁，陈波，韩超，等. HPLC法测定茶叶水提液中五种儿茶素和咖啡碱及其用于茶叶分类的研究[J]. 分析测试学报，2007，26（2）：211-215，220.

[8]朱旗，Clifford M N，毛清黎，等. LC-MS分析普洱茶和茯砖茶与红茶成分的比较研究[J]. 茶叶科学，2006，26（3）：191-194.

[9]张国民，廖予琦，王庆忠. HPLC内标标准曲线法测定茶叶中4种儿茶素和咖啡因[J]. 昆明学院学报，2010，32（3）：47-50.endprint

摘要：建立了测定茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的反相高效液相色谱分析方法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）。样品经超声提取后，利用Kromasil C18色谱柱分离，流动相为乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL），流速0.8 mL/min，检测波长278 nm，柱温30 ℃。没食子酸进样量在0.066～1.650 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 9），平均回收率为97.1%，RSD为1.1%（n=6）；儿茶素进样量在0.240～6.000 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 6），平均回收率为 97.5%，RSD为1.5%（n=6）；表儿茶素进样量在0.252～6.300 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.999 7），平均回收率为 96.9%，RSD为12%（n=6）。试验结果表明，建立的方法操作简便、数据精确，可用于茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量测定。

关键词：茶叶；没食子酸；儿茶素；表儿茶素；RP-HPLC

中图分类号： TS272.7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0322-02

收稿日期：2013-10-28

作者简介：邹盛勤（1970—），男，江西奉新人，硕士，教授，从事天然产物活性成分的提取与分析研究。E-mail：zsqycxy@163.com。

通信作者：姜琼，男，湖北潜江人，硕士，讲师，从事天然产物开发与研究。E-mail：qqj2000@163.com。茶叶为山茶科山茶属植物茶（Camellia sinensis）的芽叶。茶叶一名始载于《名医别录》，“世医治暑病，以茶叶饮为首药”[1]。茶叶全草可作药用，性微温，具有发汗解暑、行水散湿、温胃调中、利水消肿的功效[2]。我国拥有丰富的茶叶资源和数千年的茶文化历史。茶叶中具有多种活性成分，如茶多酚、茶多糖、茶皂素、可可碱、咖啡碱、挥发油、氨基酸等，其中多酚类化合物主要由没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯等30多种化学物质组成[3]，具有调血脂、降血糖、抗肿瘤、抗衰老、美容减肥等药理作用[3-5]。茶多酚的定量方法主要有高效液相色谱法和毛细管电泳法等[6-9]。茶叶化学成分的研究报道较多，但同时测定茶叶样品中没食子酸、儿茶素和表儿茶素含量的方法尚未见报道。本试验建立反相高效液相色谱法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）同时测定浙产茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的含量，旨在为茶叶中没食子酸、儿茶素和表儿茶素的定量分析及其药效基础物质的研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

没食子酸、表儿茶素和儿茶素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为：110831-200302、110877-200916、110831-200911），乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。084龙井、龙井、白茶、越剑茶和浙农113茶叶品种均购自浙江省，经鉴定为茶（C. sinensis）的芽叶。

Waters高效液相色谱仪（515泵，2996光电二极管阵列检测器，Empower中文色谱工作站，美国）；RO-MB-10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂）；CP225D电子分析天平（德国Sartourius公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SK2510HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率：250W，频率：59 kHz）。

1.2溶液配制

1.2.1对照品溶液分别精确称取1.32、4.80、5.04 mg没食子酸、儿茶素和表儿茶素对照品，置于20 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解后，稀释至刻度，摇匀后配制成含0.066 mg/mL没食子酸、0.240 mg/mL儿茶素和0.252 mg/mL表儿茶素的对照品混合溶液。

1.2.2 样品溶液茶叶样品于恒温干燥箱中80 ℃下干燥 6 h，高速粉碎机粉碎。分别精确称取2 g各茶叶样品粉末，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，分别加入50 mL 95%乙醇后称重；超声提取45 min，冷却后用甲醇补足损失重量，摇匀后用 0.45 μm 滤膜过滤，取过滤液作为样品溶液。

1.3检测波长的选择

对照品溶液采用光电二极管阵列检测器在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描，选择合适的检测波长。

1.4色谱条件

色谱柱为Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈 ∶水 ∶磷酸（90 mL ∶10 mL ∶0.1 mL）；流速 0.8 mL/min；检测波长278 nm；柱温为30 ℃。

1.5精密度试验

分别精确吸取10 μL含没食子酸、儿茶素和表儿茶素的对照品混合溶液，平行进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度。

1.6重现性试验

取5份茶叶样品，每份约2 g，按“1.2.2项”中样品溶液制备方法制备样品溶液。精确吸取样品溶液各10 μL，分别进样，测定其峰面积积分值，用外标法计算含量。

1.7加样回收率试验

精确称取6份已知没食子酸、儿茶素、表儿茶素含量的茶叶样品，每份约1 g，按高、中、低3种浓度分别加入适量对照品制备样品溶液，进样测定含量。

1.8线性关系试验

用微量注射器精确吸取1、7、13、20、25 μL含没食子酸、儿茶素和表儿茶素的对照品混合贮备液，进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标（μg），峰面积为纵坐标（μV·s）。

1.9样品含量测定

精确吸取制备的样品溶液各10 μL，平行进样3次，测定没食子酸、儿茶素和表儿茶素峰面积积分值，外标法计算平均含量。

2结果与分析

2.1检测波长

试验测得对照品溶液中没食子酸最大吸收波长为2163、271.7 nm，儿茶素最大吸收波长为203.4、278.8 nm，表儿茶素最大吸收波长为203.4、278.8 nm（图1）。因此选择278.0 nm作为检测波长，此波长下没食子酸、儿茶素和表儿茶素均有较强的紫外吸收，信噪比高，基线平稳。

参考文献：

[1]宋立人，洪恂，丁绪亮，等. 现代中药学大辞典：下册[M]. 北京：人民卫生出版社，2001：1489-1492.

[2]张国民，李平忠，孙晶. 茶叶化学成分及研究现状[J]. 农业与技术，2012，32（5）：226-226，230.

[3]姜守刚，蒋建勤，王建营，等. 茶多酚的提取分离和分析鉴定研究[J]. 药学进展，2005，29（2）：72-77.

[4]刘作春，李玉山. 恩施绿茶多糖对糖尿病模型大鼠血糖的影响[J]. 现代预防医学，2009，36（7）：1234-1235.

[5]陈建国，江月仙，来伟旗，等. 茶多糖对四氧嘧啶糖尿病小鼠调节血糖及其抗氧化作用的探讨[J]. 毒理学杂志，2009，23（4）：299-301.

[6]孙志栋，顾富强，梁月荣，等. 茶多酚提取优化工艺研究[J]. 天然产物研究与开发，2007（19）：490-493.

[7]康海宁，陈波，韩超，等. HPLC法测定茶叶水提液中五种儿茶素和咖啡碱及其用于茶叶分类的研究[J]. 分析测试学报，2007，26（2）：211-215，220.

[8]朱旗，Clifford M N，毛清黎，等. LC-MS分析普洱茶和茯砖茶与红茶成分的比较研究[J]. 茶叶科学，2006，26（3）：191-194.

[9]张国民，廖予琦，王庆忠. HPLC内标标准曲线法测定茶叶中4种儿茶素和咖啡因[J]. 昆明学院学报，2010，32（3）：47-50.endprint