老年创伤患者外周血髓源抑制细胞的变化及其意义

薛晨晨，何方军，赵建立，尹燕华，白祥军，李占飞

随着社会经济的发展，创伤发生率呈增高趋势，已成为当前国人重要死亡原因。严重创伤患者常出现免疫功能障碍，主要表现为T淋巴细胞功能抑制，是创伤患者发生继发感染和脓毒症，进而导致患者死亡的重要原因[1]。近年来我国人口老龄化趋势明显，老年人口比例显著增加。老年人免疫系统功能较年轻人明显衰退和减弱，在创伤时更易发生继发感染和死亡。但对老年患者免疫功能衰退的分子与细胞机制，目前尚知之甚少。

髓源抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)是重要的调节性免疫细胞，包括未成熟粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和髓系祖细胞等，对T淋巴细胞功能具有强大的抑制作用[2]。近年研究提示MDSCs的扩增和活化在肿瘤、类风湿性关节炎等多种疾病中起重要作用[3-4]，它也是脓毒症和创伤时免疫抑制的重要机制[5-7]。动物实验表明，老年小鼠中MDSCs数量和抑制活性均较青年小鼠显著增高，提示MDSCs扩增和活化与衰老导致的免疫抑制密切相关[8-11]。但MDSCs在不同年龄组创伤患者中有无差异，国内外均未见报道。因此，本研究比较青年和老年创伤患者外周血MDSCs数量，以增加对老年创伤患者免疫抑制发生机制的认识。

材料与方法

1 临床资料与分组

研究组： 收集2013年5月～2013年9月于我科收治的严重多发伤患者，随机选取其中18～30岁患者26例和>60岁患者21例。入选标准： (1) 创伤严重程度评分(injury severity score,ISS)≥16分； (2) 本次受伤前1月内无感染性疾病史； (3) 自起病至来我科就诊时间<24h。青年组和老年组ISS评分无显著差异。青年对照组： 9例本院健康医务人员，年龄23～30岁，均于1月内无感染病史。老年对照组： 5例健康人，年龄60～65岁，均于1月内无感染疾病史。

2 主要试剂

人CD11b-FITC抗体、CD14-PE抗体、CD33Cy5抗体以及相应的同型对照抗体均购自BD Biosciences公司(USA)； 转化生长因子-β(transform growth factor-β,TGF-β)、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)和白介素-10(interleukin-10，IL-10)的 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA)检测试剂盒为北京中科生物公司产品。

3 标本采集

参照文献报道[2]，本研究以CD14-/CD11b+/CD33+作为创伤患者外周血MDSCs的标志。创伤组患者伤后1、3、7d采集外周血2ml，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，标本采集后30min内进行处理，检测CD14-/CD11b+/CD33+细胞比例。同时采集2ml外周血(不抗凝)分离血清检测细胞因子水平。

4 流式细胞术检测外周血MDSCs比例

流式细胞术(flow cytometry，FCM)参照试剂盒说明书进行。采集患者外周血(EDTA抗凝)后混匀，取100μl全血，加入CD11b-FITC抗体、CD14-PE抗体、CD33-Cy5抗体各2μl，冰上避光孵育30min，PBS洗涤，红细胞裂解液裂解、洗涤、固定、重悬后，以FACS Canto(美国BD公司)检测。

5 ELISA检测外周血细胞因子水平

实验步骤按照试剂盒说明书进行。

6 统计学处理

结 果

1 不同年龄组创伤患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+细胞比例变化

流式细胞术检测青年组和老年组创伤患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+细胞比例，伤后1d MDSCs比例与对照组差异无统计学意义(P>0.05)； 创伤后3d和7d老年组高于青年组，差异均有统计学意义(P<0.001)(图1，表1)。

图1 不同年龄组创伤患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+细胞比例变化。两组之间行双因素方差分析； NS： 差异无统计学意义；***P<0.001

2 不同年龄组创伤患者血清细胞因子水平

ELISA检测青年组和老年组创伤患者血清TGF-β水平，老年组患者伤后1、3和7d均高于青年组，差异有统计学意义(P<0.01或0.001)(表2)。

ELISA检测青年组和老年组创伤患者血清IL-10水平，老年组患者伤后1d与青年组相比，差异无统计学意义(P>0.05)； 3d和7d均高于青年组，差异有统计学意义(P<0.001)(表3)。

ELISA检测青年组和老年组创伤患者血清CRP水平，老年组患者伤后1d和7d与青年组相比，差异无统计学意义(P>0.05)； 3d时高于青年组，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)。

3 不同年龄组创伤患者外周血MDSCs细胞比例与血清细胞因子水平的关系

创伤患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+细胞比例与血清TGF-β、IL-10和CRP水平进行相关性分析： MDSCs比例与TGF-β水平有相关性(r=0.8872，P<0.05)； MDSCs比例和IL-10水平有相关性(r=0.9298，P<0.01)； MDSCs比例与CRP水平有相关性(r=0.854，P<0.05)。

表1 不同年龄组创伤患者外周血MDSCs比例

各组均数进行双因素方差分析:*P<0.001

表2 不同年龄组创伤患者血清TGF-β水平

各组均数进行双因素方差分析：*P<0.01，**P<0.001

表3 不同年龄组创伤患者血清IL-10水平

各组均数进行双因素方差分析：*P<0.001

表4 不同年龄组创伤患者血清CRP水平

各组均数进行双因素方差分析：*P<0.05

讨 论

创伤时机体发生一系列复杂的免疫反应。在早期产生大量促炎细胞因子，表现为“过度”的炎症反应和全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)； 与此同时，机体分泌大量抗炎细胞因子，产生抗炎反应以维持内环境平衡，强烈的抗炎反应又会导致机体出现免疫紊乱和免疫抑制，T细胞功能障碍，机体对细菌的清除能力下降，发生继发感染。随着重症医学的发展和生命支持技术的进步，后期免疫抑制和继发感染已成为创伤患者的主要死亡原因。

髓源抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)是重要的调节性细胞，在维持机体免疫系统平衡中起重要作用[2]。大量研究已证实MDSCs在创伤和脓毒症免疫抑制中起重要作用,它与衰老引起的免疫功能衰退也密切相关。在鼠类，MDSCs表型为CD11b+/Gr-1+，但在人类，目前尚未发现MDSCs特异专一的分子标志。已有文献表明其表达CD11b+、CD33+、CD14-、CD13+、HLA-DR-/low，也表达CD31、CD-124、白介素-4受体α链和巨噬细胞集落刺激因子受体[2-4,7]。我们前期研究发现，创伤患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+MDSCs比例显著增高，与患者继发感染密切相关[7]。

动物实验研究显示，老年小鼠骨髓中CD11b+/Gr-1+细胞比例显著高于青年组，而且对T细胞增殖具有强烈的抑制活性，产生炎症介质水平显著高于青年组，与荷瘤小鼠中MDSCs表型一致。虽然文献报道关于人类MDSCs表型各不相同，但迄今为止报道最多的MDSCs表型为CD14-/CD11b+/CD33+/HLA-DR-，因此本研究采用CD14-/CD11b+/CD33+作为标志物检测创伤患者外周血MDSCs比例变化。我们比较了青年组和老年组创伤患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+细胞比例，结果发现，伤后1d两组无显著差异(P>0.05)，但伤后3d和7d，老年组MDSCs比例均较青年组显著增高(P<0.001)。老年创伤患者感染发生率显著高于青年组患者。本研究结果表明，老年创伤患者伤后外周血CD14-/CD11b+/CD33+细胞比例显著增高，提示它们在创伤后免疫功能障碍中起重要作用。

本研究中，伤后1d时，老年组MDSCs比例较青年组稍增高，但差异无统计学意义。其原因可能是MDSCs比例在创伤后逐步增高，因此在创伤后1d时，两组还未表现出显著差异。另外，更理想的是能同时分离MDSCs，分析它对T细胞增殖的抑制活性。在动物实验中，老年小鼠MDSCs的抑制活性显著高于青年组小鼠。但在临床患者，外周血中MDSCs数量较少，难以获得足够数量的细胞进行抑制活性检测。

值得注意的是，MDSCs是高度异质性的细胞，在创伤和脓毒症不同阶段，其特性有所不同[12]。脓毒症3d时的MDSCs输注到盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)小鼠时，可增强其促炎细胞因子分泌，减少腹腔细菌生长，但增加CLP小鼠早期死亡率。过继输注CLP后12d的MDSCs效应则与此相反。不同时期MDSCs分泌的炎症介质也有很大区别。随着脓毒症病程进展，MDSCs的表型也随之转变，由促炎状态转变为更不成熟、具有更强抗炎活性状态，但其共同特点是均对T细胞功能具有强烈的抑制活性，均会导致T细胞功能障碍。

TGF-β和IL-10均为重要的抗炎细胞因子，且均参与诱导MDSCs的产生。本研究结果显示，老年组创伤患者血清TGF-β和IL-10水平均较青年组高，提示老年组患者在创伤后更容易发生免疫抑制。同时，更高的TGF-β和IL-10水平也可能是MDSCs比例增高的重要原因。

综上所述，本研究结果表明，老年创伤患者较青年创伤患者更容易出现免疫抑制状态。老年创伤患者外周血MDSCs数量较青年患者显著增高，可能是其发生免疫抑制的重要机制，应进一步深入研究老年患者MDSCs扩增和活化的分子机制，以探索新的针对老年患者有效的免疫调理方法。

参考文献：

[1] Annane D,Bellissant E,Cavaillon JM.Septic shock[J].Lancet,2005,365(9453):63-78.

[2] Gabrilovich DI,Nagaraj S.Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system[J].Nat Rev Immunol，2009，9(3):162-174.

[3] Nagaraj S,Gabrilovich DI.Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells[J].Cancer Res，2008，68(8):2561-2563.

[4] Almand B,Clark JI,Nikitina E,et al.Increased production of immature myeloid cells in cancer patients： a mechanism of immunosuppression in cancer[J].J Immunol,2001,166(1):678-689.

[5] Delano MJ,Scumpia PO,Weinstein JS,et al.MyD88-dependent expansion of an immature GR-1(+)CD11b(+) population induces T cell suppression and Th2 polarization in sepsis[J].J Exp Med,2007,204(6):1463-1474.

[6] Makarenkova VP,Bansal V,Matta BM,et al.CD11b+/Gr-1+myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress[J].J Immunol,2006,176(4):2085-2094.

[7] 张锟，何方军，白祥军,等.创伤患者外周血CD14-/CD11b+/CD33+髓源抑制细胞数量变化及临床意义[J].中华创伤杂志，2010,26(9)：790-793.

[8] Bryk JA,Popovic PJ,Zenati MS,et al.Nature of myeloid cells expressing arginase 1 in peripheral blood after trauma[J].J Trauma,2010,68(4):843-852.

[9] Jackaman C,Radley-Crabb HG,Soffe Z,et al.Targeting macrophages rescues age-related immune deficiencies in C57BL/6J geriatric mice[J].Aging Cell,2013,12(3):345-357.

[10] Enioutina EY,Bareyan D,Daynes RA.A role for immature myeloid cells in immune senescence[J].J Immunol,2011,186(2):697-707.

[11] Verschoor CP,Johnstone J,Millar J,et al.Blood CD33(+) HLA-DR(-) myeloid-derived suppressor cells are increased with age and a history of cancer[J].J Leukoc Biol,2013,93(4):633-637.

[12] Brudecki L,Ferguson DA,McCall CE,et al.Myeloid-derived suppressor cells evolve during sepsis and can enhance or attenuate the systemic inflammatory response[J].Infect Immun,2012,80(6):2026-2034.