土黄连药材质量标准研究

★ 廖宝源 杨慧敏

(赣州市食品药品检验所 江西 赣州 341000)

土黄连为毛茛科植物短萼黄连CoptischinensisFranch.var brevisepala W.T.Wang et Hsiao的干燥根茎。性味苦、寒，归心、肝、胃、大肠经。功能清热燥湿，泻火解毒，用于胃肠湿热，脘腹痞满，呕吐，泻痢，黄疸，高热神昏，口舌生疮，心烦不寐，血热吐衄，目赤肿痛，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓[1,2]。分布于广西、江西、湖南、贵州等地，江西主产赣州、吉安、宜春、上饶、萍乡、景德镇等地，为江西省赣南及吉安地区民间常用药[2,3]。短萼黄连富含生物碱，药效显著，具有清热燥湿、泻火解毒之功效，具有广谱抗生素的作用，常用于治疗湿热内蒸、泄泻痢疾等，且具有抗癌、抗放射及促进细胞代谢等作用[4,5]。土黄连药材收载于《江西省中药材标准》1996年版，原标准只有简单的性状和显微鉴别，未对药效成分进行定性、定量检测，难以控制其药材及其成方制剂的质量和临床用药的有效性和安全性。因此，本文在土黄连原标准基础上，建立了水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、盐酸小檗碱的薄层鉴别和含量测定方法，为土黄连药材及其成方制剂的质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪(VWD检测器、四元低压混合泵、柱温箱、自动进样器、ChemStation色谱工作站)，DM500摄影摄影显微镜(德国莱卡)，USC302超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司)，GZX-DH-40ⅹ45-BS电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)，SX2-5-12 C0149箱式电阻炉(上海实验仪器厂有限公司)，梅特勒AB265-S型电子天平。

乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110713-200208)，10批土黄连药材为2013年9月收购于江西省吉安市遂川县营盘圩铜鼓村(暂定批号为THL-1-THL-10)，经赣州市食品药品检验所刘志辉鉴定为毛茛科植物短萼黄连CoptischinensisFranch.var brevisepala W.T.Wang et Hsiao的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 药材名称 本品民间习称“黄连”或“土黄连”，为与《中国药典》收载的“黄连”相区别，故将“土黄连”列为正名。

2.2 植物来源 本品为多年生草本，根状茎黄褐色，着生众多须根，多为单枝或有分枝。叶均基生，叶片坚纸质，长3～11cm，3全裂，叶中尖裂片具细柄，卵状菱形，羽状深裂，边缘有锐锯齿。侧生裂片不等地2深裂，叶柄长5～18cm；花序有3～8朵花，苞片披针形，羽状深裂；花小，萼片5，黄绿色，狭卵形，长约6.5cm，比花瓣长1/3～1/5；中央有蜜槽；蓇葖果有细柄[6]。生于山地阴凉处[3]。分布于广西、广东、福建、安徽、浙江、江西、湖南、贵州[2,3,7]，江西主产赣州、吉安、宜春、上饶、萍乡、景德镇等地。

2.3 药材性状 本品多为单枝或有分枝，略呈圆柱形，微弯曲，长1.5～4.5cm，直径0.3～0.5cm。表面黄褐色或灰黄色，结节紧密排列呈连珠状，有须根及须根残基。上部残留黑色鳞叶，顶端留有残余的茎或叶柄。质硬，断面不整齐，皮部橙红色或暗棕色，木部鲜黄色或橙黄色，呈放射状排列，髓部红黄色，偶见中空。气微，味极苦，嚼之唾液可染成红黄色。

2.4 薄层色谱鉴别

2.4.1 供试品溶液的制备 取本品粉末0.25g，加甲醇25mL，超声处理30min，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.4.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

2.4.3 薄层色谱的展开 照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述两种溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，置用浓氨试液预饱和20min的展开缸内，展开，取出，晾干。

2.4.4 显色 置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.4.5 样品检识 按上述条件对10批土黄连药材进行薄层色谱鉴别，结果各斑点分离良好，显色清晰，且各批药材薄层鉴别结果一致性较好。见图1。

1～5、7～11.土黄连药材；6.盐酸小檗碱

2.5 检查

2.5.1 水分 按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ H第一法测定[8]。见表1。

2.5.2 总灰分 按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K测定。见表1。

2.5.3 酸不溶性灰分 按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅸ K测定。见表1。

2.6 浸出物 用稀乙醇作溶剂，照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅹ A)项下的热浸法测定。见表1。

表1 土黄连测定结果

2.7 含量测定 土黄连主要含原小檗碱型生物碱，其中小檗碱含量最高，含量为5.29%～8.52%[3,9,10]。因此本文采用HPLC法建立了土黄连药材中盐酸小檗碱含量测定方法。

2.7.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil(钻石)C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50∶50)(每100mL中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0)；检测波长：345nm；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。见图2。

1.盐酸小檗碱

2.7.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得。

2.7.3 供试品溶液的制备 取本品粉末(过二号筛)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100∶1)的混合溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.7.4 线性关系考察 精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液(106μg/mL)1.0，3.0，5.0，7.0，10.0mL，分别加甲醇稀释定容至10mL，摇匀，分别进样10μL，测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算盐酸小檗碱的回归方程及相关系数，得Y=35.7752X-25.7295，r=0.9992。结果表明盐酸小檗碱在0.106～1.06μg范围内线性关系良好。

2.7.5 精密度试验 取本品细粉约0.1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定，重复6次。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.07%，表明仪器精密度良好。

2.7.6 重复性试验 取本品细粉6份，每份约0.1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，精密吸取10μL，分别注入液相色谱仪，测定。结果盐酸小檗碱含量的RSD为1.4%，表明方法重复性良好。

2.7.7 稳定性试验 取本品细粉约0.1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，分别于0，2，4，6，8，12，24h测定。结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.3%，表明供试品在24h内稳定。

2.7.8 加样回收率试验 取本品细粉6份，每份约0.06g，精密称定，分别加入盐酸小檗碱对照品溶液(以甲醇-盐酸(100∶1)为溶剂，浓度为0.212mg/mL)25mL，照供试品溶液的制备方法，自“密塞，称定重量，超声处理30min”起，依法制成供试品溶液，精密吸取10μL，分别注入液相色谱仪，测定，计算盐酸小檗碱含量及RSD，结果表明方法灵敏度高。见表2。

表2 加样回收率试验

2.7.9 药材含量测定 取本品细粉约0.1g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按上述色谱条件分别测定盐酸小檗碱的含量，结果见表1。

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别 实验考察了环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)、甲苯-异丙醇-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(5∶1.5∶3∶1.5∶0.5)、甲苯-异丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水(6∶1.5∶3∶1.5∶0.3)等不同展开系统，结果环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂时主斑点清晰，分离度较好。耐用性试验考察点样方式(点状和带状)、展开温度(4～30℃)、展开湿度(18%～65%)及预制薄层板和自制薄层板，结果带状点样，温度控制在20～30℃，湿度在47%以下时斑点清晰，分离度较好，且Rf值适中，薄层板对结果影响不大，表明该方法耐用性较好。

3.2 浸出物测定考察 实验分别采用热浸法和冷浸法，热浸法用水、稀乙醇、75%乙醇、乙醇做溶剂，冷浸法用水、乙醇做溶剂进行考察，结果稀乙醇作溶剂热浸的浸出率最高，故选取稀乙醇作溶剂热浸。

3.3 含量测定

3.3.1 波长选择 参考《中国药

典》中盐酸小檗碱的检测波长[8,12]，确定检测波长为345nm。

3.3.2 流动相的选择 参考《中国药典》中盐酸小檗碱含量测定方法，采用乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(50∶50)(每100mL中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0)为流动相，结果对照品峰形好，保留时间稳定，与其它组分分离较好。

3.3.3 供试品溶液制备的条件考察 实验考察了采用超声处理30min、超声处理1h、回流1h为提取方法，结果回流比超声提取率稍高，但考虑环保及简化操作，采用超声处理30min作为提取方法。

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