围刺配合电针对乳腺增生大鼠血清激素水平和乳腺组织形态、ER表达的影响

荆荣霞 梁立红 李霞 肖红玲 张拴成 佘延芬

·论著·

围刺配合电针对乳腺增生大鼠血清激素水平和乳腺组织形态、ER表达的影响

荆荣霞 梁立红 李霞 肖红玲 张拴成 佘延芬

目的观察围刺配合电针对乳腺增生大鼠血清性激素雌与孕激素的比值(E2/P)、泌乳素(PRL)、睾酮(T)、乳腺组织形态和乳腺组织ER表达的影响，以探讨干预治疗乳腺增生的作用机制。方法随机将40只Wistar大鼠分为模型组、针刺组、三苯氧胺组及正常组，每组10只。采用己烯雌酚联合黄体酮肌内注射进行造模。针刺组：将大鼠固定，分别围刺第2对左右乳房后，接通电针仪持续刺激30 min，并针刺膻中穴，留针30 min；三苯氧胺组予三苯氧胺1.8 mg/kg灌胃治疗，1次/d，共30 d。于末次治疗后测定血清E2、P、PRL、T含量，计算E2/P比值；取大鼠第2对乳房常规HE染色，光镜下观察组织形态表现；运用免疫组化法对乳房乳腺组织中ER表达情况进行观察。结果治疗后E2/P：针刺组与三苯氧胺组比值均低于模型组(P<0.05)。PRL：针刺组和三苯氧胺组均低于模型组(P<0.05)；针刺组与三苯氧胺组比较差异有统计学意义(P<0.05)。T：针刺组和三苯氧胺组均低于模型组(P<0.05)。乳腺组织ER表达：针刺组和三苯氧胺组大鼠乳腺组织ER阳性细胞表达情况显著降低， AOD值低于正常组(P<0.05)。结论围刺配合电针具有降低模型大鼠乳头高度、缩小乳头直径，改善血清E2/P、PRL、T紊乱状态和乳腺组织病理形态，降低乳腺增生模型大鼠乳腺组织ER表达的作用。

围刺配合电针；乳腺纤维囊性病；雌孕激素比值；泌乳素；睾酮；乳腺组织形态；ER表达；大鼠

乳腺增生临床症状以乳房肿块和疼痛为主，又可称为乳腺结构不良。随着当今社会女性工作、生活压力日趋增大，伴随晚婚晚育，导致产后缺乳，从而诱使本病发病呈逐年上升趋势。经流行病学统计显示，乳腺增生可有一定的癌变几率，致使本病的治疗引起高度重视[1]。采用围刺配合电针的方法治疗乳腺增势，是本课题组人员经多年临床实践而总结出的有效方法，为进一步探讨此方法的具体作用机制，本实验观察其对乳腺增生大鼠第2对乳头的高度和直径、血清雌孕激素比值E2/P比值、泌乳素(PRL)、睾酮(T)、乳腺组织病理形态、ER表达的影响，旨在为有效预防与治疗本病提供理论指导和实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选用河北医科大学动物实验中心提供的清洁级3月龄雌性未孕健康Wistar大鼠40只(动物合格证号：903092)，体重(230±20)g。饲养条件：温度20～26℃，明暗各12 h，清洁级动物实验室，室内采光和通风均良好，自由饮水与进食，喂饲大鼠普通饲料(河北医科大学实验动物中心提供)。

1.1.2 实验药物：己烯雌酚：天津金耀氨基酸有限公司， 1 ml/0.5 mg；三苯氧胺：扬子江药业集团有限公司，并用蒸馏水将其配制成混悬液；黄体酮：天津金耀氨基酸有限公司，1 ml/10 mg。

1.1.3 实验试剂和仪器：ER抗体由SantaCru2公司分装；ER免疫组化检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；125I泌乳素放射免疫分析药盒、125I雌二醇放射免疫分析药盒、125I睾酮放射免疫分析药盒、125I孕酮放射免疫分析药盒，均为天津九鼎医学生物工程有限公司；TDL-5-A型离心机，上海安亭科学仪器厂；FJ-2021型γ-放射免疫计数器，西安二六二厂；HMIAS-2000显微图像分析系统，武汉同济医科大学；SHB-D循环水真空泵，郑州长城；Citadel-2000包埋机，英国姗顿公司；2035型LEICA切片机，德国。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法：随机将40只大鼠分为模型组、针刺组、三苯氧胺组和正常组，每组10只。除正常组外，其余3组均肌内注射己烯雌酚注射液0.5 mg/kg，1次/d，连续25 d，然后肌内注射黄体酮4 mg/kg，1次/d，连续5 d，建立大鼠乳腺增生模型，注射位置均选取大鼠右下肢外侧[1，2]。正常组于大鼠右下肢外侧肌内注射0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续30 d。

1.2.2 治疗方法：造模成功后，①针刺组：采用自制束鼠器将实验大鼠固定，分别围刺其第2对乳房，具体位置是以乳头为中心，距乳头3 mm的半径圆上面3、6、9、12点处，选用φ0.25×13 mm毫针向内(乳头方向)平刺3 mm左右，针刺后即接通G6805-2A型电针仪，取疏密波(密波80 Hz、疏波50 Hz)，频率12次/min，强度1～2 mA，以针柄微颤动且大鼠能耐受不挣扎撕咬为度，同时膻中穴向下平刺，进针约3 mm，留针30 min。②三苯氧胺组：参考文献[3]，三苯氧胺1.8 mg/kg灌胃。③其余3组均采用针刺组同法仅将大鼠固定30 min。④其余3组均采用与三苯氧胺组同体积的蒸馏水给大鼠灌胃。4组干预方法均为1次/d，连续30 d。

1.2.3 取材与检测方法：4组大鼠末次治疗结束后，不禁水但禁食12 h，后断头取血。所取血样离心(2 000 r/min，15 min)，所得血清置于-70℃冰箱保存备用。同批测定血清E2、P、PRL、T含量严格按放射免疫分析测定分析试剂盒说明书操作，同时计算E2/P比值。无菌条件下取4组大鼠第2对乳房，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察所取4组乳腺组织的形态表现。免疫组化法检测大鼠第2对乳房乳腺组织中ER表达情况。

2 结果

2.1 围刺配合电针对大鼠血清E2/P比值的影响 模型组血清E2/P比值明显高于正常组 (P<0.05)；针刺组和三苯氧胺组均低于模型组 (P<0.05)；针刺组与三苯氧胺组比较，有下降趋势，更接近正常组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 围刺配合电针对大鼠血清PRL含量的影响 模型组明显高于正常组 (P<0.05)；针刺组和三苯氧胺组均低于模型组 (P<0.05)；针刺组与三苯氧胺组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 围刺配合电针对大鼠血清T含量的影响 模型组明显高于正常组 (P<0.05)；针刺组和三苯氧胺组均低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；针刺组与三苯氧胺组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 治疗后4组大鼠血清中E2/P和PRL、T含量比较

2.4 围刺配合电针对大鼠乳腺组织病理学的影响 光镜下，造模好的乳腺增生大鼠乳腺组织中乳腺小叶、腺泡以及腺导管数均增加，腺泡腔和腺导管扩张明显，腔内分泌物多，上皮细胞排列紊乱且增生明显。干预治疗后模型组与正常组比较，与上述结果相同。针刺组、三苯氧胺组与模型组比较，上述情况有明显改善，乳腺小叶、腺泡和腺导管数可见减少，腺泡腔及腺导管萎缩，腔内分泌物亦有所减少，上皮细胞排列较规则，均与正常组相似。见图1～4。

图1 正常组大鼠乳腺组织病理学(HE×100)

图2 模型组大鼠乳腺组织病理学(HE×100)

图3 三苯氧胺组大鼠乳腺组织病理学(HE×100)

图4 针刺组大鼠乳腺组织病理学(HE×100)

图5 正常组ER蛋白表达(IHC×100)

图6 模型组ER蛋白表达(IHC×100)

图7 三苯氧胺组ER蛋白表达(IHC×100)

图8 针刺组ER蛋白表达(IHC×100)

2.5 围刺配合电针对大鼠ER蛋白表达的影响 光镜下观察ER阳性细胞，胞核呈黄色或棕黄色。模型组乳腺组织ER阳性细胞明显增多，AOD明显高于正常组 (P<0.05)；针刺组和三苯氧胺组均低于模型组(P<0.05)；针刺组与三苯氧胺组相比存在下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图5～8。

表2 治疗后4组大鼠乳腺ER(AOD)比较

3 讨论

现代医学传统认为乳腺是多种内分泌激素的靶器官，并由此推测造成乳腺增生的主要原因可能是体内E2绝对(相对)增多，加之体内P长时间不足，引起E2/P比值失调，致使乳腺实质增生过度或(和)复旧不全[4]。PRL是由垂体远侧部的嗜酸性细胞产生，可在E2、P的共同调节作用下对乳腺的生长发育起推动作用，并能维持和促进泌乳功能。体内少量T可以促进乳腺发育，而大量T反而会抑制乳腺发育[5]。E2通过与特异性ER结合来发挥其生理作用，E2的最终响应不单取决于它本身的分泌与代谢，还与ER的表达水平及功能发挥密切相关[6,7]，乳腺组织中出现ER升高，对E2的敏感性增长，是乳腺组织增生发生发展的重要原因[8]，故观察E2/P比值及各激素水平对判定疗效具有特殊意义。参考大鼠解剖图谱和实验针灸学等相关资料，我们选择大鼠第2对乳房为目标器官，因其与人类乳房的位置接近，同时适宜针刺操作，故选其作为针刺治疗及观察乳腺组织形态、ER蛋白表达的对象。

乳腺增生属中医“乳癖”范畴。足厥阴肝经、足阳明胃经循行过乳房部，依“经脉所过，主治所及”，古今乳病多归责于肝和胃。课题组根据多年临床经验认为乳腺增生的发病主要与肝气不舒、冲任失调相关。当今社会女性工作、生活压力日趋增大，常有肝气郁结，而木克土，故又可克犯脾胃，从而可导致气滞血瘀，津凝成痰，阻于乳络，以至形成肿块；又有冲任二脉失和，下可使胞宫经水逆乱，上可使乳房气血凝滞，最终发为乳腺增生[9,10]。本病随月经周期呈现动态变化过程，气滞、血瘀、痰浊在病理状态下形成恶性循环，而成痼疾。基于对乳腺增生病因病机的独特认识，治疗理念立足气、血、痰辨治，以理气化痰、调理冲任、消瘀散结为法，另特拟围刺配合电针而治疗，临床效果颇佳。

围刺，源于《灵枢·官针》中的扬刺法，是指多针刺向病变中心，形似围剿敌寇之状，属局部多针刺法范畴，临床应用较为广泛，常用于局限性肿块、结节、麻木、疼痛等病证的治疗[11]，具有疏通经络、祛瘀消肿、软坚散结的作用。本研究中对乳腺增生大鼠第2对乳房施行围刺，所取之处均为肝、脾、胃三经循行区域，可起到疏肝理气、和胃化痰、通调乳络、消瘀散结的作用。膻中穴属任脉，为心包募穴，是任脉、手太阳、手少阳、足太阴、足少阴经的交会穴，又是宗气聚会之处，即气之会穴，刺之有宽胸理气，活血通络，消瘀散结，调理冲任的作用。

电针疗法，是在针刺后得气的基础上通过电流刺激替代行针手法，对腧穴产生刺激从而治疗疾病的一种方法[12]，本实验选用电针中具有促进局部气血循环，改善组织营养、消除炎症水肿作用的疏密波型，将传统针刺疗法与电物理技术有机结合，产生了针刺和电刺激的双重治疗作用。

实验结果显示，围刺配合电针可明显调节血清E2/P比值，同时降低血清PRL、T水平，从而改善乳腺增生模型大鼠的内分泌紊乱，明显改变乳腺组织病理形态，与文献报道[13-15]一致。其降低乳腺增生大鼠乳腺组织中ER表达，抑制ER与E2的结合，减少E2对乳腺的作用，是围刺配合电针治疗乳腺增生的作用机制之一。

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The effect of Weici combined with electric acupuncture on the expression levels of E2 /P ,prolactin,testosterone,ER and mammary gland tissue morphous in rats with mammary gland hyperplasia

JINGRongxia*,LIANGLihong,LIXia,etal.*ShijiazhuangMunicipalInstituteforMaternalandChildHealth,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo observe the effect of Weici combined with electric acupuncture on E2 /P,prolactin(PRL),testosterone(T),ER expression and mammary gland tissue morphous in rats with mammary gland hyperplasia in order to explore its action mechanism.MethodsThe 40 Wistar rats were randomly divided into 4 groups: normal control group,model group,acupuncture group and tamoxifen (TAM) group.The animal models with breast hyperplasia were established by intramuscular injection with diethylstilbestrol+progesteroner.The rats in acupuncture group were fixed and acupunctured (Weici) in the second pair of breasts，and connected with the electric acupuncture instrument for 30 min,moreover, Danzhong acupuncture point was acupunctured for 30min;the rats in TAM group were given tamoxifen 1.8mg/kg by gavage,once a day for 30 days,after last treatment,the serum levels of E2,P,PRL,T were detected,and the ratio of E2/P was calculated,the second pair of breasts were taken to be HE stained,then the changes of breast tissue morphous were observed under light microscope,and the expression levels of ER in breast tissue were detected by immunohistochemisty.ResultsAfter treatment,the ratio of E2/P in acupuncture group and TAM group was significantly lower than that in model group (P<0.05);the serum levels of PRL in acupuncture group and TAM group were obviously lower than those in model group (P<0.05),moreover,there were significant differences between acupuncture group and TAM group (P<0.05).The serum levels of T in acupuncture group and TAM group were significantly lower than those in model group (P<0.05).The pathological changes of breast tissue in acupuncture group were similar to those in TAM group,however,which were obviously improved,as compared with those in model group.The expression levels of ER of breast tissue in TAM group were significantly decreased,furthermore,the AOD value was obviously lower than that of normal control group (P<0.05).ConclusionWeici combined with electric acupuncture can decrease nipple height and nipple diameter,improve disorder state of E2/P,PRL,T and pathological morphous of breast tissue,and reduce ER expression levels in breast tissue of rats with breast hyperplasia.

Weici combined with electric acupuncture;fibrocystic disease of breast;E2 /P;prolactin;testosterone;breast tissue morphous;ER expression;rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.001

项目来源：河北省中医药管理局科学技术研究计划课题基金资助项目(编号:2008005)

050051 河北省石家庄市妇幼保健院(荆荣霞)；河北医科大学第一医院(梁立红)；冀中能源峰峰集团有限公司邯郸医院(李霞)；河北省中医学院(肖红玲、张拴成、佘延芬)

R 655.82

A

1002-7386(2014)07-0965-04

2013-10-16)