油脂中茶多酚的分析方法研究

纪姝晶等

摘要：对油脂中茶多酚进行了测定。采用硅胶固相萃取净化、经皂化处理并结合福林酚比色法进行定量测定。考察了影响固相萃取的因素，分别对清洗溶剂以及解吸溶剂进行了考察，并对去除油脂效果和茶多酚的回收率进行了测定。结果表明，最佳方案为使用6 mL石油醚洗去油脂，15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）洗脱茶多酚。

关键词：茶多酚；固相萃取；皂化；福林酚比色

中图分类号：TS227 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3159-04

Determination of Tea Polyphenols in Oil

JI Shu-jing1，WANG Yang1，MAO Wen-yue2，WANG Shan-shan3，CUI Tong1

（1.College of Sciences， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， Hebei， China 2.Heze Peony Technology Co.， Ltd， Heze 274000， Shandong， China； 3.Laiyang Luhua Group Co.， Ltd， Laiyang 265200， Shandong， China）

Abstract： Tea polyphenols（TP） in oil were determined. Solid extraction column of silica was used to clean the TP，which was saponified with an alkali and determined by Folin colorimetric method. The results showed that 6 mL petroleum ether could remove the oil impurity and 15 mL methanol containing 0.2% formic acid could recover the TP.

Key words： tea polyphenols； solid phase extraction； saponification； Folin colorimetric method

茶多酚（TP）又称茶单宁、茶鞣质，是一种羟基酚类化合物，是茶叶中酚类及其衍生物的总称。其可分为黄烷醇类、羟基-[4]-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，其中以儿茶素最多，占多酚类总量的60%～80%。研究表明，茶多酚具有抗氧化[1]、防辐射[2]、抗衰老[3]、降血脂、降血糖、抑菌抑酶[4]等多种生理活性，抗氧化活性强，且安全无毒，是良好的天然抗氧化剂。茶多酚是由水溶性茶多酚与棕榈酰氯合成的棕榈酸黄烷醇酯类化合物，易溶于油脂，具有优异的抗氧化效果[5，6]和食用安全性[7，8]，是替代合成抗氧化剂的优质材料，已经被国家有关部门批准在食用油等相关产品中使用。然而由于上述产品化学成分比较复杂，目前尚未建立一套准确可靠的定量分析方法，因而制约了其在油脂等相关产品中的应用。

目前有关茶多酚测定的报道主要涉及茶叶中天然水溶性茶多酚的测定。如GB/T 8313-2002《茶 茶多酚测定》[9]和GB/T 8313-2008[10]。黄皓等[11]研究表明，GB/T 8313-2008相对于GB/T 8313-2002 测定茶多酚含量所需试剂消耗量小、提取充分、操作便捷、灵敏度高、精密度好。而茶多酚的化学成分比较复杂，关于其分析方法至今国内外鲜有报道。因此有必要建立一套准确可靠的定量分析方法，以扩大其在油脂等相关产品中的应用。

本研究采用硅胶固相萃取净化技术、皂化处理、并结合福林酚比色法建立了一种食用油中茶多酚定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食用油由山东鲁花集团有限公司提供。硅胶固相萃取柱（1 000 mg/6 mL，30 pk月旭材料科技有限公司）。茶多酚标准品均由山东鲁花集团提供。福林酚（分析纯，上海荔达生物科技有限公司）。石油醚、甲醇、甲酸、氢氧化钾、盐酸、碳酸钠均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；101-0AB型电热鼓风干燥箱（天津泰斯特有限公司）；TB-215D型十万分之一分析天平（德国赛多利斯公司）；RE52CS型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SP-756P型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪仪器厂）；固相萃取装置（美瑞泰克科技有限公司）；800A型离心机（常州国华电器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 硅胶固相萃取小柱的预处理 将15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）上柱，清洗硅胶固相萃取小柱（柱体积为3 mL），待甲醇全部流出后，将小柱置于电热鼓风干燥箱内，于100 ℃干燥30 min后升温至105 ℃干燥3 h，活化硅胶固相萃取小柱。

1.3.2 油脂中茶多酚的固相萃取 准确称取油脂样品5.0 g，溶于5.0 mL石油醚中，混匀后上样于硅胶固相萃取小柱，控制流速1滴/2～3 s。待样品滴完后，加入6 mL石油醚去除油脂，再加入15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）解吸茶多酚，收集解吸液至蒸馏烧瓶内。

1.3.3 茶多酚的皂化 将蒸馏烧瓶内的甲醇减压蒸干，用10.0 mL乙醚转溶，转移至60 mL分液漏斗中，加入5.0 mL 2%的氢氧化钾溶液进行皂化萃取，20 min后取下层溶液，用盐酸调节溶液pH至6～7，再用0.5%的氢氧化钾溶液萃取2次，每次20 min，取下层，调节pH 6～7，合并萃取相，加水定容至25 mL容量瓶中。

1.3.4 茶多酚的测定 移取2.0 mL的皂化萃取液于比色管中，加入10%的福林酚溶液5.0 mL，摇匀后于3～8 min之内加入7.5%的碳酸钠溶液3.0 mL，显色1 h（显色后若出现白色浑浊必须离心）后在765 nm下测定吸光度，根据标准曲线定量。

1.3.5 色谱分析条件 色谱柱为Kromasil硅胶色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；检测波长，306 nm；流速，0.8 mL/min；柱温，35 ℃；进样量10 μL。图1使用的流动相，石油醚∶乙酸乙酯=9∶1（V/V），图2使用的流动相，石油醚∶乙酸乙酯=7∶3（V/V）。

2 结果与分析

茶多酚是一种混合物，组成比较复杂，不适于HPLC法测定其总含量。采用经过酸性甲醇溶液活化的硅胶柱对油脂样品中茶多酚进行富集，使用石油醚去除油脂，再用极性较强的洗脱剂进行洗脱，最后进行测定。目前已有文献报道[12-17]茶叶中的水溶性茶多酚含量分析的方法，但它不适于直接用于茶多酚的分析，因此要进行皂化反应，将茶多酚转化为水溶性茶多酚，再测定其总含量。

2.1 溶剂的选择

图1为流动相为石油醚∶乙酸乙酯（9∶1，V/V）茶多酚标准品的HPLC色谱图；图2为流动相石油醚∶乙酸乙酯（7∶3，V/V）茶多酚标准品的HPLC色谱图。当流动相为石油醚∶乙酸乙酯（9∶1，V/V）时，茶多酚标准品正相色谱图在30 min内基本无峰，说明茶多酚吸附在正相柱上几乎未被洗脱；而改变流动相，增强它的极性，变为石油醚∶乙酸乙酯（7∶3，V/V）时，茶多酚正相色谱图在2～15 min出峰，说明茶多酚大部分被洗脱下来。为了确保更高的回收率，固相萃取时选用用极性较弱的洗脱溶剂去除油脂和脂溶性杂质，用极性较强进行解吸，实现了茶多酚与脂溶性的杂质分离。

2.2 石油醚洗脱去除油脂的效果

准确称取油脂样品5.0 g，溶于5.0 mL石油醚中，混匀后上样于硅胶固相萃取小柱，控制流速1 滴/2～3 s，将上样流出液收集于试管中。依次加入3 mL石油醚去除油脂，每份柱体积洗脱液分别接收至不同试管中，挥干石油醚后称重。不同体积的石油醚去除油脂的效果如图3所示。

从图3可以看出，石油醚的体积越大，除去油脂的效果越好，当洗脱体积为6 mL时，石油醚对油脂的去除率达到95.2%，且随着洗脱体积的增加，石油醚除去油脂的量变化不大，所以本试验石油醚洗脱体积确定为6 mL。

2.3 石油醚洗脱对茶多酚造成的损失

石油醚尽管是极性很弱的洗脱溶剂，但是在去除油脂的同时，仍会带走一定量的茶多酚，对茶多酚测定造成一定的影响。将5.0 mL浓度为0.1 mg/mL的茶多酚标准品溶液，上样于活化好的硅胶固相萃取柱，依次加入3 mL石油醚，每倍柱体积分别接收至不同试管中，定容至5 mL，于765 nm下测定吸光度，根据各管吸光度值占上样液吸光度的百分比，计算损失情况，图4为不同体积的石油醚洗脱油脂时对茶多酚的损失率。

从图4可以看出，石油醚洗脱体积越大，带走的茶多酚越多，损失越大，当洗脱体积为6 mL时，茶多酚损失率为7%。

2.4 酸性甲醇回收茶多酚效果

将5.0 mL浓度为0.1 mg/mL的茶多酚标准品溶液，上样于活化好的硅胶固相萃取柱，加入6 mL石油醚去除油脂，再依次加入3 mL酸性甲醇解吸茶多酚，每个柱体积解吸液分别接收至不同试管中，挥干甲醇后，用石油醚定容至5 mL，于756 nm下测定吸光度，根据各管吸光度值占上样液吸光度的百分比，计算回收效果，如图5所示，酸性甲醇洗脱体积越大，茶多酚的解吸越彻底，为了提高解吸效率，采用15 mL的酸性甲醇洗脱，茶多酚解吸率为97.4%。

2.5 油脂样品中未被石油醚除去的油脂对茶多酚测定的影响

在茶多酚的固相萃取步骤中，采用6 mL的石油醚洗脱，只能去除约95%的油脂，剩余的部分是油脂中天然存在的一些极性成分，它们不能被弱极性的石油醚洗脱除去，却会被极性更强的酸性甲醇解吸下来，经过皂化，显色测定，产生吸光度，对茶多酚的定量产生影响。为了测定这些成分的影响，使用空白油样，按照本试验方法进行测定，结果如图6所示。

从图6中可以看出，随酸性甲醇的洗脱回收体积增大，被回收的极性成分越多，产生的吸光度越大，使用15 mL的酸性甲醇回收时，杂质的吸光度是0.293，将作为本底被扣除。

2.6 标准曲线的绘制

用石油醚将茶多酚的标准品配制成质量浓度（mg/mL）分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60的标准工作液，按照“2.2”所述方法，经过硅胶柱对油脂样品中茶多酚进行富集，用石油醚去除油脂，再用酸性甲醇解吸茶多酚，然后用氢氧化钾溶液皂化，福林酚比色法测定茶多酚的含量，然后以吸光度为纵坐标，茶多酚的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，结果如下：标准回归方程：y=0.000 7x-0.038 1（R2=0.956 6）。

2.7 重现性和回收率试验

将质量浓度为0.100、0.200 mg/mL的茶多酚标准品加入空白样品油中，按照试验方法测定3次，计算该方法的重现性及回收率，结果如表1所示。

3 小结与讨论

本试验初步探索了茶多酚的分析方法。采用硅胶固相萃取分离茶多酚，用6 mL石油醚去除油脂，15 mL酸性甲醇（0.2%甲酸）解吸茶多酚，经氢氧化钾皂化。最后采用福林酚比色法，于765 nm下测定吸光度，并与标准曲线对照，计算出茶多酚的含量。

本方法操作简单，不需要复杂分析仪器，分析结果准确可靠，可以作为食用油中茶多酚总含量分析的常规检测方法，为其质量监控提供了检测手段，以上这些分析结果为茶多酚在油脂中的开发利用提供了新的科学根据。

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