血管性认知障碍大鼠学习记忆、血清EPCs、NO、VEGF变化及电针的干预作用

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(1.安徽医学高等专科学校，合肥 230601；2.安徽中医药大学第二附属医院，合肥 230061；3.安徽中医药大学，合肥 230038)

·实验研究·

血管性认知障碍大鼠学习记忆、血清EPCs、NO、VEGF变化及电针的干预作用

钱善军1,陈幸生2*,周婷2,程红亮2,张闻东2,李飞2,蔡荣林3,吴生兵3,陈国庆3,王储蓄3,何俊良3

(1.安徽医学高等专科学校，合肥 230601；2.安徽中医药大学第二附属医院，合肥 230061；3.安徽中医药大学，合肥 230038)

目的 观察电针对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆、内皮祖细胞(EPCs)数量、氧化亚氮(NO)及血管内皮生长因子(VEGF)的影响。方法 四血管阻断制作VD模型大鼠,水迷宫检测大鼠学习记忆能力、流式细胞术检测外周血内皮祖细胞(EPCs)数量、ELISA放射免疫法检测VEGF含量、硝酸还原酶法检测NO并与茴拉西坦对照。结果 与空白对照组比较，电针能够改善血管性认知障碍大鼠的学习记忆能力，提高外周血血管内皮祖细胞的数量，升高血清NO和VEGF水平。结论 电针可通过促进内皮祖细胞的增殖、分化，上调血管生长因子NO和VEGF表达，从而促进脑微血管新生，恢复神经功能，提高学习记忆能力。

血管性认知障碍；针灸疗法；内皮祖细胞；血管新生；大鼠

血管性认知障碍(VCI)是伴随着脑血管病的发生出现的一种记忆、认知和行为等障碍的综合征，其中较为严重的又称血管性痴呆(VD)。近年来，随着我国老龄人口的不断增多，血管性痴呆这一问题日益突出。流行病学调查[1]表明:我国VD发病率占老年痴呆症病例的比例逐年上升，已成为影响我国中老年人健康和生活质量的常见病、多发病。血管性认知障碍发病机制较为复杂，目前尚无特别有效的治疗方法,从治疗“血管新生(Angiogenesis)”入手是治疗缺血性疾病的常用手段之一。大量研究[2-5]提示：针灸对VD具有多环节、多层次、多途径的调整作用，可以产生清除自由基、改善脑血液循环、调节记忆相关神经递质、保护脑神经元等作用。国内对针灸影响脑内血管新生的机制研究较少，笔者对血管性认知障碍大鼠脑内血管新生与电针干预机制进行了研究。报道如下。

1 材料

1.1 动物及分组 选择清洁级成年雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，购自安徽中医药大学实验动物中心。经1周适应性饲养后,进行学习训练，筛除训练过程中反应过于迟钝或敏感的大鼠。随机选取12只作为假手术组(假模型组)，其余大鼠制作血管性认知障碍模型，模型制作后第4天用跳台实验结合潜伏期成绩测试再次筛选合格认知障碍大鼠并保留36只,随机分为3组，电针实验组(治疗组)、空白对照组(模型对照组)和西药治疗组(茴拉西坦组),每组12只。

1.2 主要仪器与试剂 仪器:G6805-1型电针治疗仪(青岛华声仪器厂)；SDQ-30双极射频电凝器(上海华谊仪器制造厂)；Morris水迷宫(北京新天地科技公司)；XD-711酶标仪(上海迅达医疗器械公司)；FC-500流式细胞仪为Beckman Coulter公司产品。试剂：NO试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20120519)；VEGF ELISA试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司，批号Z1ZFBZAA02)；细胞标记物CFS-conjugated-anti-humanVEGFR2/KD由R&D公司提供；PE-conjugated-anti-human CDl33/ACl33由eBioscience公司提供；PC5-conjugated-anti-humanCD34由Beckman Couher公司提供。

2 方法

2.1 血管性痴呆模型复制 参考文献[3]方法稍加改良制作VD动物模型。方法：大鼠麻醉后俯卧固定于立体定向仪，暴露双侧第一颈椎横突翼小孔,用直径0.5 mm的电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。第2天再将大鼠仰卧固定，小心分离双侧颈总动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，间隔1 h后再夹闭10 min，共夹闭3次。颈总动脉夹闭2 min内瞳孔不散大者弃之。伤口缝合前局部使用抗生素防止感染。假手术对照组手术过程同VD组大鼠但不热凝椎动脉、不夹闭颈总动脉。

2.2 干预方法 1)电针实验组：大鼠固定于鼠板，用特制的大鼠头部固定器固定大鼠头部，在大鼠的清醒状态下，选取百会、大椎、神庭、水沟穴剃毛点记，按照人体穴位的定位方法并参照大鼠骨骼与体形确定穴位。用φ0.3 mm×15 mm毫针沿皮刺进针5 mm或斜刺，百会穴与大椎、神庭与水沟成对分别接G6805电针仪，疏密波，强度以大鼠能耐受为度，通电20 min。1次/d，10次为1疗程，共治疗3疗程，疗程之间休息2 d。2)西药治疗组:茴拉西坦0.062 5 g/kg体质量，与蒸馏水混合成0.01 g/mL浓度的溶液，灌胃1次/d，疗程与电针实验组平行。3)空白对照组：与电针实验组平行，只作鼠板上固定而不作其他任何处理。

2.3 检测方法

2.3.1 行为学记忆成绩测试 电针及西药治疗结束后开始水迷宫检测。水迷宫内水深41 cm，水温22～26 ℃。在水池壁标明4个入水点将水池等分为4个象限，随机选择一个象限正中放置平台，没于水下1 cm，水面覆盖塑料泡沫。1)定位航行试验历时6 d，1次/d。将受试大鼠按顺时针方向依次由4个入水点顺序面向池壁放入水中，记录2 min内寻找平台的时间(即逃避潜伏期)。如果大鼠在2 min内找到平台，记录其实际逃避潜伏期;如果在2 min内未找到平台，由实验者将其引上平台并停留10 s，逃避潜伏期记录为2 min。2)空间探索试验定位航行试验结束后撤去平台，然后任选一相同入水点将大鼠放入水中，测其2 min内跨跃原平台及其余3个象限相应平台位置的次数。

2.3.2 流式细胞术检测外周血EPCs数量 电针实验组大鼠于每个治疗疗程结束后1 h，眼眶取血。放于EDTA抗凝管，Ficocl密度离心梯度法收集单个核细胞。分别加入CD34-PC5，CDl33-PE，KDR-FITC3于获取的单核细胞样本中，避光孵育30 min。采用流式细胞术检测单个核细胞悬液，每份标本检测20万个细胞，获得流式细胞散点图，从中圈出单个核细胞散点区，对所圈的单个核细胞进行分析，计数CD34、CDl33、KDR均为阳性的细胞数量，即内皮祖细胞数量。其余3组取血方法与电针法实验组相同，时间上与之平行。

2.3.3 血管新生相关因子检测 电针及西药治疗结束后，各组大鼠眶静脉取血,常规分离血清,ELISA放射免疫方法检测VEGF含量；硝酸还原酶法检测NO。实验操作步骤严格按照说明书进行。

3 结果

3.1 各组水迷宫学习记忆行为学检测结果 见表1。

表1 各组水迷宫学习记忆行为学检测结果±s,n=12)

注：与假手术组比较，##P<0.01；与空白对照组比较，△△P<0.01

3.2 各组外周血内皮祖细胞数量检测结果 见表2。

表2 各组外周血内皮祖细胞数量检测结果±s,n=12) 个/20万个细胞

注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.3 各组血清NO/VEGF检测结果 见表3。

表3 各组血清NO/VEGF检测结果

注：与假手术组比较，##P<0.01；与空白对照组比较，△△P<0.01

4 讨论

血管性痴呆属于“中风痴呆病”范畴。电针是中医临床治疗VD的常用方法之一。既往研究发现针灸治疗VD，在改善临床症状，降低病死率方面具有肯定的疗效。

研究[6-8]显示，外周血EPCs数量可作为内皮功能和缺血性疾病的独立危险因素之一,增加外周血或缺血脑组织中的EPCs数量，则有可能促进缺血脑组织的侧支循环重建和血管新生，有利于改善缺血脑组织的血液供应，保护神经元，恢复脑组织的功能，从而提高学习记忆能力。NO是众多血管生长因子的下游介质,来自内皮的NO是诱导血管生成所必需的，具有调节血管生成因子，刺激血管生成的作用，能够延长内皮细胞生命周期，增强内皮细胞的增殖和迁移力。VEGF被认为是最具影响的血管新生活性物质，在体外可促进内皮细胞增生，在体内可诱导血管新生，在脑缺血后新生血管形成中起主要作用。故血清VEGF、NO含量可以有效反映脑组织中VEGF、NO的合成状态。

本研究结果显示，电针能够改善血管认知障碍大鼠的学习记忆能力，升高外周血血管内皮祖细胞的数量，升高血清NO和VEGF水平。提示电针可能通过促进血管内皮祖细胞的增殖、分化，上调缺血脑组织中血管生长因子NO和VEGF表达，从而促进脑微血管新生，恢复神经功能，提高学习记忆能力。本研究对针灸临床防治VD提供了理论基础，但其具体机制尚需进一步深入研究。

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ElectroacupunctureonlearningmemoryandEPCs,NO,VEGFofvasculardementiarats

QIAN ShanJun1,CHEN Xingsheng2*,ZHOU Ting2,CHENG Hongliang2,ZHANG Wendong2,LI Fei2,CAI Ronglin3,WU Shengbing3,CHEN Guoqing3,WANG Chuxu3,HE Junliang3

(1.Anhui Medical College,Hefei 230601,China;2.Second Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230061,China;3.Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230038,China)

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture on learning memory ability and the changes of EPC,NO,VEGF in plasma of vascular dementia (VD) rats.MethodsAfter induced by 4-vessle occlusion,morris water maze tests were conducted for evaluating the rats learning-memory ability,the contents of EPCs in plasma were measured by flow cytometry,VEGF was determined by ELISA,NO by Nitrate reductase respectively,and compared to aniracetam.ResultsCompared to the control group,electroacupuncture could elevate the learning and memory ability,increased the content of EPCs,NO and VEGF.ConclusionElectroacupuncture can elevate the learning and memory ability by Promoting angiogenesis.

vascular cognitive impairmet;acupuncture;endothelial progenitor cells;angiogenesis;rat

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.05.004

安徽省自然科学基金项目(1208085MH126)。

钱善军,博士,副教授。研究方向:中医药防治老年病。

] 陈幸生，教授，主任医师，电话：13866703678，电子信箱：chenxs202@126.com。

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：2095-6258(2014)05-0770-03

2014-03-19)

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