南瓜不同部位抗菌活性研究

向阳，董昌金

(1.黄石市第二人民医院, 湖北黄石 435002; 2.湖北师范学院生命科学学院, 湖北黄石 435002)

南瓜不同部位抗菌活性研究

向阳1，董昌金2

(1.黄石市第二人民医院, 湖北黄石 435002; 2.湖北师范学院生命科学学院, 湖北黄石 435002)

利用乙醇、甲醇和蒸馏水作提取剂分别提取南瓜不同部位(瓜皮、瓜肉、瓜瓤)中的抗菌物质，并通过滤纸片法、琼脂孔扩散法测定其抗菌活性。实验结果显示，南瓜的甲醇提取液对枯草芽孢杆菌(G+)和大肠杆菌 (G-)的抑菌作用更为明显，且瓜瓤中抗菌物质含量最为丰富； 南瓜的甲醇-瓤提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度为10%，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为15%； 初步鉴定瓜瓤中有良好抗菌活性的成分为脂溶性物质。

南瓜；脂溶性物质；抗菌活性

南瓜(Pumpkin )， 分类上属于葫芦科、南瓜属，是一年生蔓生草本植物, 原产墨西哥以及中美洲地区，明代传入我国，世界各地普遍栽培。南瓜含有淀粉、蛋白质、胡萝卜素、B族维生素、维生素C和钙、磷等成分; 同时，含有人体多种必需氨基酸，其中赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸含量较高。南瓜不仅可以食用，而且还有一定的食疗价值。据《滇南本草》记载：南瓜性温，味甘无毒，入脾、胃二经，能润肺益气，化痰排浓，驱虫解毒，治咳止喘，疗肺痈与便秘，并有利尿、美容等作用； 南瓜中含有能抑制微生物生长的抗菌活性物质，对真菌、细菌生长有良好的抑制作用，作为天然食品抗菌剂有广阔的应用前景[1～3]。目前，国内外在南瓜抗菌物质的研究方面尚属空白，抗菌物质的提取分离是南瓜作为天然防腐剂应用的基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

成熟南瓜； PDA培养基；牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2供试菌种

枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis，G+) ，大肠杆菌 (Escherichia coli, G-)。

1.3试剂及溶液

95%乙醇(分析纯，武汉市中天化工有限公司)，甲醇(分析纯，武汉市江北化学试剂厂)，蒸馏水。

1.4细菌菌悬液的制备

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基活化后，分别用无菌生理盐水配制成菌悬液。在超净工作台内，用接种环挑取活化后的菌种于液体培养基内摇匀，置于摇床内培养18～24h后，将获得的菌液逐步稀释成10-1、10-2、10-3……10-7系列不同梯度的菌悬液。

1.5南瓜材料的处理

选择皮较硬，成熟期长，肉质呈桔红色的南瓜作为实验材料。先将南瓜洗干净，分离其瓜皮、瓜肉、瓜瓤, 并置于55℃烘箱中烘干后粉碎，将瓜皮、瓜肉、瓜瓤不同部分的粉末分别做好标记，并置于4℃冰箱内保存待用。

1.6南瓜抗菌物质的提取

分别取3份低温储存的南瓜瓜皮、瓜肉、瓜瓤粉末(每份各取5g)：一份(瓜皮、瓜肉、瓜瓤)分别倒入装有25mL蒸馏水的三角瓶中; 另2份分别置于装有25mL甲醇、95%乙醇的三角瓶中。用锡箔纸封住瓶口，将这9个锥形瓶置于55℃的水浴锅中浸提[4]。3h后进行抽滤，收集滤液；将留下的滤渣再分别取25mL对应的提取溶剂用同样的方法重复浸提3次，合并用相同溶剂提取的提取滤液，于4℃冰箱中储存备用。

1.7南瓜抗菌物质抑菌实验

1.7.1 滤纸片法测定南瓜抗菌物质的抑菌作用 将滤纸剪成半径为6mm圆片，灭菌后分别浸泡在南瓜瓜皮、瓜肉、瓜瓤的提取液以及对照液(95%乙醇、甲醇和蒸馏水)中过夜[5]。无菌条件下，将PDA培养基倒平板，分别吸取0.2mL各供试菌液，加入到每个对应平板后用涂布棒涂布均匀。每平板等距离放置3片浸泡南瓜提取液及对照的滤纸片，每个处理3次重复，并置于37℃恒温培养箱中培养48h.测定抑菌圈的大小，比较南瓜不同部位及不同提取方法的抑菌效果。

1.7.2 琼脂孔扩散法测定南瓜抗菌物质的抑菌活性 无菌条件下，将PDA培养基倒平板，分别吸取0.2mL各供试菌液，加入到每个对应平板后涂布均匀。用无菌金属打孔器( d =6mm) 在培养基中心打1 个小孔，分别吸取0.2mL南瓜不同部位的提取物加入孔内，并设置提取溶剂作空白对照。将处理及对照培养皿置于37℃恒温培养箱中培养 48h后用十字交叉法测量有效抑菌圈直径，实验重复3次。

1.8南瓜提取液最小抑菌浓度的测定

选取试验效果最好的瓜瓤部分的提取液配制成2.5%、5%、10%、15%、20%、25%、30% 7个浓度梯度的稀释液各50mL[6].无菌条件下，每个平皿内分别取2mL不同浓度的提取液，倒入15mL已灭菌的固体培养基中，充分混匀，静置，冷却、凝固后，再分别往平皿中加入0.2mL菌液，涂布均匀，置于恒温培养箱中培养，每个浓度梯度3个重复。48h后观察实验结果，以不长菌的提取液的最低浓度为最小抑菌浓度。

1.9南瓜瓜瓤不同成分抑菌效果比较

取5g瓜瓤粉用20mL无水乙醇50℃水浴1h进行脱脂，离心，收集脱脂上清液及沉淀；将50mL无水乙醇加入沉淀中60℃下水浴4h后离心(4000r/min，10min)，收集上清液，重复抽提两次，合并上清液；上清液中加丙酮至80%浓度，反复脱色，将沉淀用无水乙醇溶解离心，4000r/min下离心10min得胶质沉淀，最后于45℃～60℃下进行干燥处理得褐色胶质状糖蛋白提取物，用考马斯亮蓝法测定提取物中蛋白质含量，检测提取物中是否含有蛋白质成分[7，8]。最后，将所得的溶液和沉淀提取物分别进行抑菌实验。抗菌物质的提取步骤如下：

2 结果与分析

选取皮较硬，成熟期长，肉质呈桔红色的南瓜作为实验材料，采用不同提取方法(95%乙醇、甲醇和蒸馏水浸提)的提取液以及南瓜不同部位(瓜皮、瓜肉、瓜瓤)提取的抗菌物质的抑菌效果进行比较研究。

2.1南瓜抗菌物质不同提取方法的抑菌效果

采用浸提的方法，分别用95%乙醇、甲醇(100%)和蒸馏水作溶剂对南瓜瓜皮、瓜肉、瓜瓤中的抗菌物质进行抽提，通过滤纸片法、琼脂孔扩散法测定其提取液的抑菌作用(分别以95%的乙醇、甲醇和无菌蒸馏水做为对照)，用十字交叉法测定抑菌圈的大小，取两种方法的平均值来确定不同提取溶剂对抑菌效果的影响。其实验结果见表1：

表1 不同提取方法的抑菌效果

由表1可知，南瓜的甲醇提取液对两种供试菌株(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)的抑菌作用明显强于蒸馏水提取液和95%的乙醇提取液，95%的乙醇提取液抑菌效果十分不明显。且在相同的提取方法中提取液对大肠杆菌(G-)比对枯草芽孢杆菌(G+)的抑菌作用更为明显。而甲醇、95%的乙醇和蒸馏水(对照)对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均无抑制作用。

2.2南瓜不同部位提取液的抑菌效果

表1和图1、图2的实验结果显示南瓜的甲醇提取液抑菌效果更为显著。南瓜不同部位(瓜皮、瓜肉和瓜瓤)甲醇提取液的抑菌效果见表2.

表2 南瓜不同部位的甲醇提取液抑菌效果比较

由表2可知：南瓜的甲醇-瓤提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用最为显著；南瓜的甲醇-肉提取液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌无明显的抑菌效果；南瓜的甲醇-皮提取液对大肠杆菌有抑菌效果，但对枯草芽孢杆菌无明显的抑菌效果。

图1 南瓜提取液对大肠杆菌的抑菌效果

图2 南瓜提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌效果

2.3南瓜瓜瓤甲醇提取液最低抑菌浓度测定

根据抑菌实验中抑菌圈的大小，选取成熟南瓜瓜瓤不同浓度的甲醇提取液做最低抑菌浓度测定。实验结果见表3：

表3 南瓜瓜瓤甲醇提取液最低抑菌浓度测定

由表3可知，南瓜瓜瓤甲醇提取液对大肠杆菌的最低抑菌浓度为10%，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为15%.说明该提取液对大肠杆菌的抑菌效果最好，与之前滤纸片法、琼脂孔扩散法的抑菌实验结果相吻合。

2.4南瓜瓜瓤不同成分抑菌效果比较

南瓜瓜瓤主要成分为脱脂液和褐色胶质状物质，该物质经考马斯亮蓝结合法检测鉴定其主要成分为糖蛋白。 通过滤纸片法可以比较瓜瓤脱脂液和糖蛋白提取液的抑菌效果(见表4)。

表4 南瓜瓜瓤不同成分对大肠杆菌的抑菌效果比较

瓜瓤糖蛋白对大肠杆菌无明显抑菌效果，瓜瓤脱脂液对大肠杆菌的抑菌效果显著，初步鉴定瓜瓤中的脂溶性物质有良好的抑菌效果。

3 讨论

南瓜为一年生双子叶草本植物，不仅有较高的食用、食疗价值，而且还有防腐抑菌作用。不同的提取方法及南瓜不同部位对南瓜的抗菌效果有显著的影响；南瓜的甲醇-瓤提取液对大肠杆菌(G-)、枯草芽孢杆菌(G+)的抑制作用最为显著，作为天然食品防腐剂具有广阔的应用前景。瓜瓤糖蛋白对大肠杆菌无明显抑菌效果，瓜瓤脱脂液对大肠杆菌的抑菌效果显著，初步鉴定瓜瓤中的脂溶性物质有良好的抑菌作用。其有效抑菌成分的鉴定和抑菌机理有待进一步探索；同时，南瓜的甲醇-瓤提取液对大肠杆菌(G-)比对枯草芽孢杆菌(G+)的抑菌作用更为明显。实验结果显示南瓜的甲醇-瓤提取液中的抑菌成分对G+菌的抑菌效果较差，其原因需进一步研究和分析。

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ThestudyforantisepticactivityofPumpkin

XIANG Yang1, DONG Chang-jin2

(1. The Second People's Hospital of Huangshi City, Huangshi 435002，China; 2. College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002，China)

In this study, the antibacterial material was extracted by 95% ethyl alcohol, methyl alcohol and distilled water in different parts of the ripe Pumpkin(pericarp, sarcocarp and melon pulp). Filter paper method and agar diffusion method were used to measure the antiseptic activity of antibacterial material. The trial results showed that inhibitory effect of the methyl alcohol extract of pumpkin on Bacillus subtilis (G+) and Escherichia coli (G-) was more obvious than others , and the antibacterial material content is most abundant in the melon pulp. The minimum inhibition concentration (MIC) of the antibacterial material to E. coli was 10%, and 15% to B. subtilis. Preliminary conclusion can be drawn that antibacterial activity components were liposoluble substance in the melon pulp.

pumpkin; Liposoluble substance; antiseptic activity

2014—07—20

向阳(1962— )，男，湖北黄石人，副主任医师。

Q53

A

1009-2714(2014)03- 0046- 05

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.03.011