HPLC–MS/MS法测定南美白对虾苗中硝基呋喃类代谢物残留*

郑丹，杨家锋，钟惠英，姜小敏

（宁波市渔业环境与产品质量检验监测中心，浙江宁波 315012）

硝基呋喃类药物(Nitrofuran antibiotics)作为一类广谱抗生素被广泛应用于动物饲料和治疗药物中，由于硝基呋喃在治疗动物肠胃病方面效果明显，故被应用于南美白对虾育苗环节。研究表明该类药物可能诱导有机体基因突变且具有遗传毒性，欧美等国已将其列为违禁药物，我国也将其列为食品动物的禁用兽药。硝基呋喃类药物主要包括呋喃唑酮(Furanzolidone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃妥因(Furantoin)、呋喃它酮(Furaltadone)4种，该类药物在动物体内会迅速分解，其代谢物可与蛋白质紧密结合形成稳定残留，因此目前通常以测定其代谢物的方式来说明硝基呋喃类药物在动物体内的含量［1-10］。

南美白对虾是宁波市水产养殖主导产业之一，是宁波市水产品出口创汇的少数优势品种，因此保证南美白对虾的食用安全对于保障百姓身体健康和扩大出口至关重要。随着百姓对食品安全问题的日益关注以及政府对水产品质量安全监管的重视，水产苗种作为水产养殖业重要的投入品，它的安全关系到水产品安全问题的源头，也是各级渔业行政主管部门主抓的工作之一，因此测定南美白对虾苗中的硝基呋喃类抗生素代谢物有重要意义。

近年来高效液相色谱质谱联用技术越来越多地应用于硝基呋喃类代谢物残留的测定，与高效液相色谱紫外检测器法比较，质谱检测技术采用多反应监测(MRM)模式，结合液相保留时间及MRM特征离子对进行定性和定量分析，可以大大减少由于保留时间相同而待测离子不同所带来的干扰，并且提高了检测灵敏度，尤其适合于基质复杂样品的分析，将这一技术应用于南美白对虾苗种硝基呋喃类代谢物残留测定，将有利于渔业行政主管部门对水产苗种企业的监管和水产品质量安全的提升［11-17］。目前尚无高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定南美白对虾苗种中硝基呋喃类抗生素代谢物的相关报道。笔者对该方法进行了研究，确定了实验条件，所建方法测定结果的精密度和准确度满足药物残留检测要求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用仪：Waters 2695-Quattro micro mass型，美国Waters公司；

超声波清洗机：KS-120D型，宁波科生公司；

均质机：DJ-Ⅱ型，上海炳隆机电公司；

漩涡混匀仪：MS3数显型，德国IKA公司；

恒温水浴摇床：SHA-C型，常州国华公司；

台式离心机：DL-8M型，上海离心机械研究所；

旋转蒸发仪：R215型，瑞士BUCHI公司；

分析天平：BP211D Ma型，感量为0.000 1 g，德国Sartorius公司；

乙酸乙酯：分析纯；

乙腈、甲酸、2-硝基苯甲醛：色谱纯；

盐酸溶液：0.2 mol/L；

氢氧化钠溶液：2.0 mol/L。

1.2 标准溶液配制

表1列出了硝基呋喃代谢物的名称。

表1 硝基呋喃代谢物名称及缩写

AOZ，AMOZ，SEM ·HCl，AHD ·HCl标准物质：纯度不低于98%；

同位素内标溶液：AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3和 SEM ·HCl-13C-15N2，质量浓度均为 100 μg/mL ；

AOZ，AMOZ，SEM，AHD标准储备溶液：质量浓度均为1.0 mg/mL，分别准确称取一定量AOZ，AMOZ，SEM，AHD，用甲醇溶解并分别定容至10 mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存；

混合标准工作溶液：准确吸取AOZ，AMOZ,SEM,AHD标准储备溶液，用流动相[乙腈-甲酸缓冲溶液（体积比20∶80）]逐级稀释配制成100 ng/mL和10 ng/mL混合溶液，于4℃冷藏保存；

混合内标工作溶液：准确吸取同位素内标溶液，用甲醇逐级稀释配成50 ng/mL混合溶液，于4℃冷藏保存。

1.3 样品采集

南美白对虾苗及对应苗池水样品取自2007～2011年每年4～5月间，样品采集覆盖了宁波市慈溪、宁海、象山、鄞州、奉化等南美白对虾苗主要生产区，涵盖了宁波市大型育苗场的95%，抽取苗种规格均为0.7～1.0 cm仔虾。

1.4 样品前处理

取南美白对虾苗样用均质机制成均质糜样备用，称取样品2.0 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中，加入200 μL混合内标工作溶液，再加入10 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液和 100 μL 2-硝基苯甲醛，涡旋振荡50 s后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16 h。取出离心管冷却至室温，加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液约2.0 mL，再调节pH至7.0～7.5，加入 10 mL 乙酸乙酯，涡旋振荡 50 s，以4 000 r/min 离心5 min，取上层清液转移至50 mL旋转蒸发瓶中，再加入10 mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并上清液旋转蒸发至干，准确加入1.0 mL乙腈-甲酸缓冲溶液（体积比20∶80），涡旋振荡溶解残留物，过0.45 μm滤膜，待测。标准工作曲线制作时，用100 ng/mL和10 ng/mL混合标准工作液配制系列标准使用液，不加样品，其余等同样品前处理过程。

1.5 仪器工作条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：SHISEIDO MGⅢC18柱(2.0 mm×100 mm)；流动相：乙腈-甲酸缓冲溶液(体积比20∶80），梯度洗脱（洗脱程序见表2），流速为0.2 mL/min；柱温：30℃；进样体积：10 μL；进样时间：20 min。

1.5.2 质谱条件

离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式；离子源温度：120℃；脱溶剂气流：600 L/h；扫描模式：选择反应监测模式；选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表3。

表2 流动相梯度洗脱程序

表3 选择反应监测4种硝基呋喃类药物代谢物的质谱条件

2 结果与分析

2.1 衍生化时间对回收率的影响

衍生化时间的设定对样品测定结果有很大影响，如图1所示。实验发现衍生化时间超过12 h后，AOZ，SEM回收率较好且稳定，而AMOZ，AHD衍生时间达到16 h才有稳定的回收率。当衍生时间小于12 h时，4种硝基呋喃类代谢物不能保证每次都衍生完全，尽管AOZ在衍生化6 h就能有较好回收率，但回收率并不稳定，且并未随时间的延长而呈比例增大。因此同时测定硝基呋喃4种代谢物时，应选择衍生时间大于16 h。

图1 不同衍生化时间对回收率的影响

2.2 色谱柱的选择

考察了Waters atlantis C18(2.1 mm×150 mm)柱和SHISEIDO MGⅢC18(2.0 mm×100 mm)柱对待测物的分离效果，结果表明，SHISEIDO MGⅢC18柱灵敏度高于waters atlantisC18柱，而waters atlantisC18柱的稳定性较好，综合考虑选择SHISEIDO MGⅢC18柱。

2.3 流动相的选择

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-2 mmol/L乙酸铵、乙腈-1‰甲酸溶液等不同流动相对4种硝基呋喃代谢物的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，以乙腈-1‰甲酸溶液作为流动相时，可获得最优的色谱分离效果和质谱信号响应。

2.4 工作曲线方程、检出限和定量限

配制质量浓度为0.2～50 ng/mL的系列标准溶液，按照样品的前处理方法进行衍生化和提取后，利用高效液相色谱-串联质谱进行测定。以色谱峰面积(Y)对被测组分的质量浓度(X)进行线性回归，AOZ，AHD，SEM，AMOZ的回归方程和相关系数见表4。在阴性样品基质中添加4种标准溶液（AOZ，AMOZ的添加水平为0.10 μg/kg，SEM，AHD的添加水平为0.25 μg/kg），当信噪比(S/N)大于5时，计算AOZ，AMOZ的检出限为0.10 μg/kg，SEM，AHD的检出限为0.25 μg/kg。在阴性样品基质中添加4种标准溶液（AOZ，AMOZ的添加水平为0.40 μg/kg，SEM，AHD的添加水平为0.50 μg/kg），当信噪比 (S/N)大于 10时计算 AOZ，AMOZ的定量下限为0.40 μg/kg，SEM，AHD的定量下限为 0.50 μg/kg，见表 4。

表4 工作曲线方程、线性范围、检出限和定量限

2.5 方法回收率和精密度试验

选取阴性样品，添加4种硝基呋喃类代谢物标准品和相应内标，添加水平为 2.50，10.0 μg/kg，每个水平做6个平行加标回收试验，结果见表5。

表5 回收率和精密度试验结果(n=6)

由表5可知，加标回收率为88.2%～97.6%，相对标准偏差为4.6%～6.8%，由此可见方法的精密度和准确度较高。

3 结语

采用液相色谱串联质谱技术建立了南美白对虾苗的硝基呋喃类代谢物测定方法，对样品前处理的提取净化条件、液相色谱分离条件和串联质谱测定条件进行了优化。该方法具有稳定性好、灵敏度高的特点，其线性、准确度和精密度均能满足药物残留测定要求。该方法样品前处理过程简单、净化效果好，适合于大批量样品的快速检测，该研究为政府相关部门对南美白对虾苗硝基呋喃类代谢物的监督提供了参考。

［1］Hu Xiaozhong，Xu Ying，Yediler Ayfer. Determinations of residual furazolidone and its metabolite，3-amino-2-oxazolidinone (AOZ)，in fish feeds by HPLC-UV and LC-MS/MS，respectively［J］. Journal of agricultural and food chemistry，2007，55(4):1 144-1 149.

［2］Pascal M，Seu-Ping K，Eric G，et al. Quantitative determination of four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A，2005,1 067: 85-91.

［3］丁涛，徐锦忠，沈崇钰，等.高效液相色谱-串联质谱联用测定蜂王浆中的四种硝基呋喃类药物的代谢物［J］.色谱，2006，24(5):432-435.

［4］生威，李季，许艇.动物性产品中硝基呋喃类抗生素残留检测方法研究进展［J］.农业环境科学学报，2006，25(Z1): 429-434.

［5］Effkemann S, Feldhusen F. Triple-quadrupole LC-MS-MS for quantitative determination of nitrofuran metabolites in complex food matrixes［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2004，378(4): 842-844.

［6］Laure Tribalat，Olivier Paisse，Guy Dessalces，et al. Grenier-Loustalot.Advantages of LC-MS-MS compared to LC-MS for the determination of nitrofuran residues in honey［ J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，386(7-8): 2 161-2 168.

［7］Cañada-Cañada F，Muñoz de la Peña A，Espinosa-Mansilla A.Analysis of antibiotics in fi sh samples［ J］. Anal Bioanal Chem，2009，395(4): 987-1 008.

［8］Wang Chuanxian，Huang Fan，Wang Min，et al. Determination of metabolite residues of nitrofuran antibiotics in aquatic products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Chromatography，2013，31(3): 206-210.

［9］Xu Zhenlin，Shen Yudong，Sun Yuanming，et al. Novel hapten synthesis for antibody production and development of an enzymelinked immunosorbent assay for determination of furaltadone metabolite 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone(AMOZ)［J］. Talanta，2013，103: 306-310.

［10］Víctor Hormazábal，Tone Norman Asp. Determination of the Metabolites of Nitrofuran Antibiotics in Meat by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry［J］. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies，2005，27:2 759-2 765.

［11］Colin S Thompson, Imelda M Traynor, Terence L Fodey,et al.Screening method for the detection of a range of nitrofurans in avian eyes by optical biosensor ［J］. Analytica Chimica Acta，2011，700: 177-181.

［12］McCracken R J，Kennedy D G. Determination of the furazolidone metabolite，3-amino-2-oxazolidinone，in porcine tissues using liquid chromatography-thermospray mass spectrometry and the occurrence of residues in pigs produced in Northern Ireland［J］.J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1997，691(1): 87-94.

［13］Chen G L，Fang Y Y. The LC-MS/MS Methods for the determination of specifi c antibiotics residues in food matrices ［J］.Methods Mol Biol，2011，747: 309-314.

［14］Mulder P P J，Zuidema T，Keestra N G M，et al. Determination of nifursol metabolites in poultry muscle and liver tissue.Development and validation of a confi rmatory method［J］. The Analyst，2005，130(5): 763-771.

［15］Mottier P，Khong S P，Gremaud E，et al. Quantitative determination of four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-electrospray ionisation-tandem mass spectrometry［J］. J Chromatogr A，2005，1 067(1-2):85-91.

［16］Mayda I Lopez，Mark F Feldlaufer，Anthony D Williams，et al.Determination and confirmation of nitrofuran residues in honey using LC-MS/MS［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(4): 1 103-1 111.

［17］李耀平，林永辉，贾东芬，等.水产品中硝基呋喃代谢物残留快速检测新方法的研究［J］.分析测试学报，2008，27(7): 712-717.