HIF－1α、VEGF、MMP－9、Ki－67在原、复发脑胶质瘤中的表达及意义

脑胶质细胞瘤简称为胶质瘤 (Gliomas)，是颅内最常见的恶性肿瘤，总体发病率高，约为12/10万，居颅内肿瘤第一位，约占成人原发性颅内肿瘤的60%［1］，国内报道总的发病率约占颅内肿瘤的35.26%～60.96%，平均为44.69%［2］脑胶质细胞瘤可发生于任何年龄段，其生长速度快，侵袭性和转移性强，预后差，其治疗原则是手术切除，后虽辅以放、化疗，但复发率仍高，常常在短期内复发，是神经外科研究领域难点和医学研究的重要课题之一。本研究应用免疫组织化学方法检测正常脑组织和原发、复发胶质瘤中HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四种因子的表达情况，并探讨其与胶质瘤复发之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组资料对照组为正常脑组织10例，取自颅脑外伤患者内减压或脑出血减压术的非肿瘤患者，并将他们制备成蜡块。实验组为2007年2月至2011年11月潍坊市人民医院神经外科收集的同一患者经手术切除并经病理科证实的原发、复发脑胶质瘤30例，其中男19例，女11例，平均年龄47.9岁。取每一位患者2次术后石蜡病理蜡块共计60块。并按照2000年WHO制定神经系统肿瘤分类标准确定60块病理蜡块的分类和分级:I级5块，Ⅱ级19块，Ⅲ级21例，Ⅳ级15例。为方便统计，将I级和Ⅱ级归为低度恶性组，将Ⅲ级和Ⅳ级归为高度恶性组。

1.2 实验材料 鼠抗人 HIF－1α单克隆抗体，兔抗人VEGF多克隆抗体，兔抗人MMP－9多克隆抗体，兔抗人Ki－67单克隆抗体，通用型PV－6000二步法免疫组化试剂盒，S－P法免疫组织化学染色试剂盒和DAB显色试剂盒，除HIF－1α购自北京博奥森生物技术有限公司，其余试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色 全部10例对照组标本和全部60块标本经甲醛固定和石蜡包埋后，进行HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67因子的表达检测，所有蜡块行连续切片6张，层厚4μm，其中1张行苏木精－伊红 (HE)染色确定病理诊断，1张备用，其余4张采用S－P免疫组织化学染色法检测HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表达情况，严格按照说明书规范操作。

1.4 结果判定

1.4.1 定性判定方法 阴性对照:用PBS代替一抗作阴性对照，结果为阴性;阳性对照:用北京博奥森生物技术有限公司和北京中杉金桥生物技术有限公司提供的阳性标本作为阳性对照。阳性结果:阳性结果镜下为棕褐色或棕黄色，HIF－1α为细胞核和 (或)细胞浆着色，VEGF，MMP－9，Ki－67为细胞浆着色。

1.4.2 定量判定方法 染色结果判定:采取半定量计数法进行评判，根据染色强度分为四个等级:阴性为0分;弱阳性 (淡黄色)为1分;阳性 (黄色)为2分;强阳性(棕黄色)为3分;根据阳性细胞数占总视野细胞数的百分比进行分级:＜5%认为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，50%以上为3分。2个分值相加0分为 (－)，1～2分者为弱阳性 (+)，3～4分者为阳性 (++)，5～6分者为强阳性 (+++)。

1.5 统计学分析 所有试验数据由SPSS13.0统计学软件进行分析，根据实验资料，应用配对资料的符号秩和检验对胶质瘤复发前后的病理级别进行比较;应用配对t检验，对原发和复发胶质瘤中 HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表达情况分别进行比较;应用Fisher's确切概率法对正常脑组织和胶质瘤之间的HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表达进行比较;应用两独立样本t检验对所有胶质瘤各个级别胶质瘤之间HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表达进行比较;应用spearman等级相关分析验证HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67之间的相关性;应用spearman等级相关分析验证胶质瘤复发时间和原发胶质瘤病理级别、HIF－1α表达强度、VEGF表达强度，MMP－9表达强度，Ki－67表达强度之间的相关性;以P＜0.05认为结果有统计学差异。

2 结 果

在10例正常脑组织中均未见 HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67的表达，60例胶质瘤中HIF－1α表达41例，表达率68.33%;VEGF表达39例，表达率65.00%;MMP－9表达47例，表达率78.33%;Ki－67表达45例，表达率75.00%，HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67在胶质瘤中的表达强度与正常脑组织之间以及低度恶性组和高度恶性组之间均具有统计学差异P＜0.05。胶质瘤复发后有21例病人病理级别增强，6例不变，3例下降，经配对资料的符号秩和检验P＜0.05，认为胶质瘤复发后病理级别增加。经配对t检验说明HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67在胶质瘤复发组中的表达高于原发组，且两组之间有差别有统计学意义 (P＜0.05)，说明复发后侵袭性得到增强。经spearman等级相关分析HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四者之间两两相关 (P＜0.05)，但胶质瘤复发时间跟原发胶质瘤病理级别、HIF－1α表达强度、VEGF表达强度，MMP－9表达强度，Ki－67表达强度之间均无统计学意义。

3 讨 论

胶质瘤作为一种恶性肿瘤，它有三种主要的生理特性过程;增生/增殖、血管新生、侵袭［3］。胶质瘤复发的定义为原发性胶质瘤术后以及其它治疗后肿瘤再次生长，且复发胶质瘤的部位比较局限，国外学者认为80%以上的复发性胶质瘤出现在原发灶周围2 cm范围，这可能与胶质瘤的生物学特征有关［4］。尽管绝大多数胶质瘤都可以选择手术治疗，尽量完全切除瘤体，但肿瘤呈侵润性生长，可侵入到正常脑组织，无论在肉眼和显微镜下肿瘤都难以彻底切除，说明手术完全切除是不可能的，术后虽结合放化疗，虽然很少转移至其他器官，但多数患者仍复发或进展，侵润到周边邻近组织的残留肿瘤细胞成为复发根源，肿瘤复发成为一种常见。由于胶质瘤这种特性，临床上治疗这类疾病目前还无法根治，目前仍主要依赖手术联合放、化疗，采取综合治疗，但预后不佳，易复发，但胶质瘤复发时间的长短不一，主要认为胶质瘤细胞自身的生物学特性是肿瘤复发的关键，而肿瘤患者的年龄、性别、精神情绪、营养状况及胶质瘤的部位和大小跟胶质瘤的复发尚无明确定论。这一切生物学特性导致其成为神经外科研究领域难点和医学研究的重要课题之一。

近10余年来随着分子生物学技术的发展特别是肿瘤分子生物学平的快速提高，越来越多的国内外学者再次开始仔细研究胶质瘤细胞发生、发展以及复发的分子生物学特性和机制，特别是胶质瘤细胞的缺氧环境适应、缺氧状态应激和调节，细胞凋亡 (apoptosis)、增殖失控、原癌基因和抑癌基因的激活与失活以及细胞外基质 (Extracellular matrix)的降解都参与了胶质瘤的发生和发展和复发，也逐渐认识到胶质瘤的发生和复发在分子和基因水平的研究是一个多因素、多基因参与的多步骤的复杂过程，并重新成为胶质瘤研究重点，并有望成为胶质瘤治疗和预防或延缓胶质瘤复发的新靶点。目前认为胶质瘤的侵袭和复发受多种基因、蛋白以及细胞因子的调控，其中以缺氧坏死因子(HIF－1α)、血管内皮生长因子 (VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP－9)、核增殖抗原表达基因 (Ki－67)为典型。

缺氧诱导因子 (Hypoxia inducible factor－1 HIF－1α)是 Semenza GL，Agani F，Booth G［5］等学者在 1992 年首次在缺氧诱导细胞的提取物中发现的一种在缺氧条件下与促红细胞生成素 (erythropoietin，EPO)基因3'增强子特异性结合的蛋白质。HIF－1由HIF－1α和HIF－1β2个亚基组成，2种亚基具有缺氧诱导因子的许多共同特征，但HIF－1α比HIF－1β更起关键作用，是主要的调节亚基和功能亚基单位，它决定着HIF－1的活性。在人类多种恶性肿瘤细胞中高表达，对肿瘤的增殖、血管的生成、能量代谢、红细胞生成、细胞凋亡和预后皆有重要作用。恶性肿瘤细胞的快速生长，使其处于缺氧和营养缺乏环境中，而肿瘤长期处于缺氧状态，可诱导HIF－1α因子的释放，从而在肿瘤细胞中高表达。HIF－1在原发性胶质瘤中的表达随病理级别的增高而增高［6］，但对于复发胶质瘤还没有深入研究，仅有学者有提出HIF－1有激发胶质瘤发展及复发的作用。本研究结果表明在10例正常脑组织中HIF－1α因子中无阳性表达，HIF－1α因子在脑胶质瘤中呈阳性表达，并且随着肿瘤恶性程度的增加，阳性表达率升高，在高度恶性组与低度恶性组中表达有显著差异，同时本研究说明HIF－1α因子在复发胶质瘤组中的阳性表达高于原发组。这提示在高度恶性的脑胶质瘤细胞相比低度恶性的缺氧更加明显，复发后胶质瘤细胞缺氧比原发组更加显著。这都充分说明缺氧是引起HIF－1α表达增强的重要机制［7］，胶质瘤的快速复发同样说明复发时肿瘤细胞快速增值，缺氧更加明显。同时说明抑制HIF－1α的表达，可以抑制胶质瘤细胞的侵袭和延缓复发能力，目前HIF－1α在肿瘤中的高表达已使其成为抗肿瘤药物研究中新的研究靶点，这种与胶质瘤发生、发展密切相关的生物学特征可作为胶质瘤基因治疗的新途径，可以通过抑制HIF－1作为治疗胶质瘤和阻止复发的靶点，并可作为胶质瘤放疗的敏感指标［8］。

另外胶质瘤的血管形成在肿瘤的生长和浸润中也起着重要作用，胶质瘤的侵袭性生长是一个多因素、多步骤的复杂过程，这其中包括被大家熟知的血管内皮细胞生长因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF)家族，VEGF是由Ferrara等学者在1989年首先纯化分离出来的一种肝素结合因子。VEGF是一种二聚体糖蛋白，分子量为45 KD，基因位于6p21.3上，基因组长14 kb，其中包含8个外显子和7个内含子。VEGF是新生血管形成的中心调控因子，其主要功能包括 (1)由于肿瘤细胞在快速生长过程中对氧和营养的需求量过大，而缺氧恰为VEGF最强烈的诱导剂，因而导致VEGF大量分泌，加速血管内皮细胞的增生和分化，促使新生血管生成;(2)VEGF可激活血管内皮细胞基因，增强尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)和组织型纤溶酶原激活物 (tP－A)，并减弱纤溶酶原激活剂抑制物(PAI－1)的表达，进而诱导蛋白水解酶、间质胶原酶和组织因子的产生来促进血管的形成［9］;(3)VEGF促使血管内皮细胞产生MMP－9，使凝血酶原转化为凝血酶，激活明胶酶原A降解原来的基膜，促使血管形成［10］;(4)VEGF可通过细胞内钙调节蛋白及磷酸肌醉途径增强NO合酶(NOS)表达，导致NO生成增多，进而促进新生血管网建立和管腔的形成。所有这些都提示VEGF与胶质瘤的发展、转移、诊断、复发及预后有的密切的关系。

基质金属蛋白酶9(MMP－9)是基质金属蛋白酶家族中较为重要的一种，而一种130千道尔顿的MMP－9被认为是可以合成其它形式的蛋白酶，MMP－9不仅在胶质瘤的侵袭性中有重要贡献，在血管生成中也参与其中，同时也参与退化血脑屏障和神经细胞［11］。MMP－9在胶质瘤的发生和发展中起重要作用，且随着胶质瘤恶性程度的增加，其病理级别也随之增加，在MMP－9的表达中，MMP－9的表达强度与胶质瘤恶性程度正相关，即胶质瘤的恶性程度越高其MMP－9的表达强度越强［12］。而在胶质瘤复发中，MMP－9同样起着重要作用，在胶质瘤复发后MMP－9表达得到进一步增强［13］在体外试验研究中，也表明在恶性神经胶质细胞瘤复发过程中，MMP－9起着非常重要的作用，MMP－9在复发胶质瘤患者的脑脊液检测中，其水平可明显升高，且用强力霉素这种特异性的MMPs抑制剂可阻断MMMPs中MMP－2和 MMP－9的活性［14］，此外这预示MMP－9可以预示胶质瘤的早期进展，它可以作为胶质瘤进展的一个标记。Ki－67是一种存在于增殖细胞核的非组蛋白性核蛋白，由345kd和395kd两条多肽链组成，其半衰期短，Ki－67表达同细胞周期密切相关，更能反映肿瘤的增殖活性，在正常脑组织中几乎不表达，而在胶质瘤中表达，且是目前增殖活动研究中非常可靠地增殖标志，也是目前应用最广泛的增殖细胞标志之一［15］。其中MMP－9和Ki－67在肿瘤细胞的增殖和分化中起着重要作用，是表达肿瘤侵袭性和侵润性的良好指标，其表达也一起与肿瘤的复发有关。

本课题研究的30例患者平均复发时间为17.7个月，最短复发时间为2.0个月，最长复发时间为39.7个月，将复发时间数据跟原发胶质瘤病理级别、HIF－1α表达强度、VEGF表达强度，MMP－9表达强度，Ki－67表达强度之间经统计学处理，得出复发时间跟五者之间均无统计学意义。但本实验HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－6四种细胞因子经spearman等级相关分析，表明两两之间存在相关性，四种因子在复发胶质瘤中的表达明显比原发胶质瘤中的表达强度增加，且统计学有意义;说明四者在胶质瘤的发生、发展、增值和复发过程中起着重要作用，其中MMP－9启动子的活性是由HIF－1α调控［16］，HIF－1α是在缺氧条件下稳定和刺激MMP－9的表达，更能诱导MMP－9基因在肿瘤中侵袭，从而影响肿瘤的侵润，进来研究中HIF－1α作用机制中已明确其能增加MMPs如MMP－2和MMP－9的表达［17］，酶谱分析表明，MMP－9在有氧条件下比缺氧条件下更能刺激明胶酶的活性，并得出HIF－1α通过MMP－9的依赖机制能促进细胞的侵袭，未来的抗肿瘤细胞药物可直接作用于目标HIF－1α和MMP－9。另外，VEGF促使血管内皮细胞产生MMP－9，使凝血酶原转化为凝血酶，激活明胶酶原A降解原来的基膜，促使血管形成［10］780－786。因此HIF－1α因子在胶质瘤的增值、侵润、转移和复发中都有极其重要的作用，是肿瘤发生转移、侵润的启动子，如果能有效的阻滞HIF－1α因子的启动，将更加有效的控制肿瘤的侵润乃至控制复发。

综上所述，HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四种因子之间相互影响、相互调控，为以后的靶向治疗和临床预后评价提供新的思路和见解，HIF－1α，VEGF，MMP－9，Ki－67四者联合检测可以评定脑胶质瘤的生物学行为，也可以作为评价胶质瘤复发的生物学指标。

(此文图1－4见附页4)

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