两种前列腺癌细胞株中E钙粘素和波形蛋白的表达意义

黄 勇，闫 骏,朱小军

0 引言

前列腺癌容易发生骨转移，一般来讲，患者前去就诊之时，已有近一半的患者发生了骨转移[1-3]。从临床经验上看，前列腺癌患者出现骨转移是一个重要的临床特征，说明患者的死亡率将大幅度升高[4]。但是，目前前列腺癌发生骨转移的相关机制尚不明了，对于癌细胞发生转移来讲，其脱离原发病灶，继而增强自身运动能力是前列腺癌细胞完成转移的关键[5]。因此，在临床上鉴定E钙粘素和波动蛋白这两种蛋白是研究前列腺癌发生骨转移机制的重要手段,而这两种蛋白出现于LNCaP和IA8这两种细胞株中，其中E钙粘素与肿瘤关系十分密切，其下降时，会造成细胞间的粘附力下降，最终细胞脱落，尤其在前列腺癌、肺癌及胃癌中，E-钙粘素的下降，其肿瘤发生转移要高于其他肿瘤，且相关研究证实，E-钙粘素的缺失，在前列腺癌细胞株中的表现较为明显，可见其参与了细胞的转移和侵袭。而波形蛋白，其在浸润和转移中，会影响细胞骨架及细胞的生物学行为，它也是中间纤维的主要成分之一，所以，检测为E钙粘素和波形蛋白，对于临床治疗分期及药物疗效评估具有重要的意义。笔者从实验的角度对前列腺癌LNCaP和IA8两种细胞株中的E钙粘素以及波形蛋白的表达情况使用Western印迹法进行鉴定，分析了不同转移潜能以及在前列腺癌转移过程中的作用机制，具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验细胞株：LNCaP和IA8。抗体及试剂：兔抗人多克隆E钙粘素抗体，鼠抗人单克隆波形蛋白抗体，鼠抗人单克隆β-肌动蛋白抗体，羊抗鼠和羊抗兔均进行碱性磷酸酶标记。显色试剂盒采用NBT/BCIP试剂盒。培养液使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。1%的NP-40细胞裂解液：1%NP-40，150 mmol/L的NaCL，50 mmol/L的Tris，0.1%的SDS，200 μg/mL的PMSF，0.5%的脱氧胆盐酸，50 μg/mL的抑肽酶，pH=7.4,考马斯亮蓝G-250。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 使用RPMI 1640培养液在含5%二氧化碳，温度为37 ℃的孵化箱中进行培养。消化传代混合液使用1.25 g/L胰酶+0.2 g/L的EDTA。经过胰酶消化和PBS冲洗液漂洗后，将标本转移到1.5 mL的Eppend rof管内。然后使用1% NP-40细胞裂解液对细胞进行裂解，剧烈震荡后将细胞充分悬浮混合均匀，静置于4 ℃的环境中0.5 h，然后使用离心机离心10 min，离心率为15 000 r/min，然后提取上清液总蛋白。经考马斯亮蓝G-250定量之后，放入100 ℃沸水中煮10 min进行变性。

1.2.2 Western印迹法 鉴定方法：选择Western印迹法，每孔样品为30 μg，使用10%的SDS-PAGE凝胶于80 V电压之下进行分离，然后将电压调低至25 V，待SDS-PAGE凝胶上的蛋白半干后转移至NC膜上，然后使用5%的脱脂奶粉将NC膜封闭，2 h之后，加入稀释度为1∶100的兔抗人多克隆E钙粘素抗体，鼠抗人单克隆的波动蛋白抗体，以及鼠抗人单克隆的β-肌动蛋白抗体。在4 ℃的孵化箱中孵化过夜，然后使用TPBS进行充分漂洗后，加入经过碱性磷酸酶标记的稀释度为1∶500的羊抗兔IgG和稀释度为1∶200的羊抗鼠IgG，在孵化箱中孵化2 h后，使用NBT/BCIP试剂盒进行显色，再使用图像分析仪进行NBT/BCIP试剂盒显色的条带进行灰度分析。

2 结果

经过分析显示，E钙粘素在LNCaP中存在高表达，在IA8中却缺失(图1)，而波形蛋白却在IA8中存在高表达，在LNCaP中缺失(图2)，可见E钙粘素和波形蛋白在LNCaP和IA8细胞表达中差异有统计学意义(P<0.01)，而β-肌动蛋白在二者的表达中差异无统计学意义(P>0.05)，但二者的E钙粘素/β-肌动蛋白及波动蛋白/β-肌动蛋白差异有统计学意义(P<0.01)，具体见表1。

表1 LNCaP和IA8细胞株中的E钙粘素、波形蛋白和β-肌动蛋白表达对比

图1 E钙粘素在LNCap以及IA8中的电泳结果

图2 波形蛋白在LNCap以及IA8中的电泳结果

3 讨论

前列腺癌容易发生骨转移，临床前列腺癌的前期诊断不易，因此，一般患者前去就诊之时，已经有30%～50%的患者发生了骨转移[6]。前列腺肿瘤的转移是一个非常复杂的过程，同时也是一个有序的过程。在整个的前列腺肿瘤转移过程中，肿瘤存在着粘附性大幅度下降，基质大部分降解和癌细胞的迁移性大幅度增强的临床特征[7]。根据一般的临床经验，如果前列腺癌患者发生骨转移就是一个非常重要的标志性临床特征，说明至此之后患者的死亡率将大幅度提高[8]。这是因为前列腺癌细胞之间的粘附性大幅度下降之后，癌细胞的自身运动能力得到了大幅度的增强，从而使癌细胞有可能脱离本来的原发病灶，对周围的组织进行浸润，继而向远处转移[9]。一旦患者的前列腺癌细胞发生大规模的转移，其必然会导致患者的全身细胞受到威胁，最终患者的死亡率将升高。

但是，目前对前列腺癌发生骨转移的相关机制还不十分清楚。对于癌细胞发生转移，从上文的分析来看，癌细胞脱离原发病灶，继而增强自身运动能力是前列腺癌细胞完成转移的关键条件。在前列腺癌细胞转移的过程中，E钙粘素和波动蛋白发挥了非常重要的作用。因此，在临床上鉴定E钙粘素和波动蛋白这两种蛋白实现研究前列腺癌发展骨转移机制的重要手段。然而，这两种蛋白主要存在于LNCaP和IA8这两种细胞株中[10]。

E钙粘素是钙粘素家族中重要的一员,钙粘素是一系列具有相似结构和功能的单链跨膜糖蛋白族[11]。根据这些钙粘素本身的来源进行区分，可以分为神经型钙粘素(N)、上皮型钙粘素(E)和胎盘型钙粘素(P)3种。钙粘素构成细胞主要依赖于其本身的粘附性，其可以作为受体，对维持细胞之间的黏附和保持细胞的完整性有重要作用。但是，在三种类型的钙粘素中，E钙粘素主要参与了前列腺癌细胞的转移，如果E钙粘素的表达降低，细胞之间的粘附性必然会大幅度下降，从而导致了细胞的病变性脱落。其实，不仅仅是前列腺癌，在其他的诸如肺癌、头部肿瘤、胃癌等恶性肿瘤中，E钙粘素的低表达都提示了癌细胞存在转移的特征。从研究文献的结论上看，已经有大量的研究表明，E钙粘素的表达与上皮型的肿瘤转移有着非常密切的关系。进一步的研究表明，E钙粘素表达的下降，甚至是缺失是与前列腺癌的转移程度和能力之间存在着负相关关系[11-12]。

然而，要完成前列腺癌细胞的转移，细胞的粘附性下降，最终脱落只是第一步，关键性的一步是细胞脱落之后运动能力增强。与此密切相关的是中间纤维，其中波动蛋白就是其非常重要的一种中间纤维。其主要分布于上皮细胞、肌细胞、神经元细胞、神经胶质细胞中，其与前列腺癌细胞的生长，分化，游走，迁移有着很大的关系。根据以往的研究结果，异常的波动蛋白表达容易导致细胞骨架蛋白的质量发生根本性改变，使得细胞骨架蛋白发生结构性的改变，上皮细胞由原来的立方型转变为纺锤纤维型，使得细胞更容易发生游走迁移，同时作为细胞内部信息传递载体的细胞骨架蛋白排列发生了结构性改变，严重干扰了细胞骨架与胞外基质的跨膜反应，使得粘着斑、微丝及膜受体之间的活性状态发生了失控，不能调节细胞的运动和黏附，促进了细胞解体和脱落，游走迁移。而相关研究得出，细胞内外信号是通过细胞骨架进行传递的，其是一个有效载体，在正常状态下，胞膜与细胞骨架是相连的，且与细胞外的基质有跨膜反应，其可以控制粘着斑以及微丝和膜受体的活性，从而进一步调节细胞的粘附与运动，而波形蛋白的异常表达，则可造成骨架系统排列出现变化，进一步对信号的传导产生干扰，促成了细胞生物学性状的改变[13-15]。本研究中，在IA8这种高转移细胞株中，波形蛋白的表达要显著高于LNCaP，从而再次证实了波形蛋白的上调，可以作为前列腺癌细胞转移能力的一种体现，可促进其转移，因此，可以通过这两个蛋白，检测癌症发展进程，对于指导用药及判断药物疗效具有重要的意义。

总之，前列腺癌患者的LNCaP和IA8细胞株中确实存在着E钙粘素和波形蛋白表达差异，说明E钙粘素和波形蛋白在前列腺癌的转移过程中发挥着重要促进或者抑制作用，这对探讨前列腺癌细胞骨转移的机制并最终对抗前列腺癌有重要意义。

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