利用蛋白质组学技术研究益生菌酸耐受应答过程中相关蛋白的变化

杨 静 王进波 齐莉莉 姜淑贞

(1.浙江大学宁波理工学院，宁波 315100;2.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)

将菌体预先暴露在较温和的酸胁迫环境中进行酸适应，可提高菌体在致死性酸胁迫环境中的耐受能力，这种能力被称为细菌的酸耐受应答(ATR)。酸耐受应答能够提高益生菌对胃酸的耐受力，有助于其顺利抵达肠道后段，并在其中黏附、定植，发挥免疫调节功能［1］。

Goodson等［2］在1989年首先发现了细菌的酸耐受应答现象，他将埃希氏大肠杆菌放入非致死酸环境中适应一段时间后，该菌可以在致死酸度下正常存活。Jan等［3］将对数生长期的费氏丙酸球菌SI41直接置于pH 2.0环境中，30 min后该菌存活率仅为4.3%;若将此菌在pH 5.0的环境中培养适应1 h后，再转移至pH 2.0环境中，活菌数则没有显著降低，说明在此过程该菌产生了酸耐受应答反应。之后，研究人员陆续发现了一些有益菌，如乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等也存在酸耐受应答现象［4］。在酸耐受应答过程中，细菌的能量及代谢状态会发生改变，而这些改变的直接执行者即为蛋白质。借助蛋白质组学技术鉴定分析细菌在酸耐受应答过程中相关蛋白表达水平的变化，可以让人们更直接地了解细菌代谢状态的改变。

1 碳水化合物代谢相关蛋白在酸耐受应答过程中的变化

Zhai等［5］发现，德氏乳杆菌在酸适应后主要碳水化合物代谢酶发生差异性表达。利用液-质联用仪进行的分析表明，该菌中多种与碳水化合物代谢相关蛋白的表达水平发生改变，包括糖酵解途径相关蛋白，如葡萄糖激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶等;丙酮酸代谢相关蛋白，如乙酸激酶;磷酸戊糖途径相关蛋白，如6-磷酸葡糖脱氢酶等。丙酮酸对细胞代谢至关重要，在细胞内可被乳酸脱氢酶还原成乳酸供能或被氧化脱羧生成乙酰辅酶A，进而合成脂肪酸［6］。在酸适应阶段，保加利亚乳杆菌丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰转移酶的表达水平升高，而乳酸脱氢酶的表达水平没有显著变化。这意味着乳酸合成减少，乙酰辅酶A产量增加，使得细胞膜脂肪酸的合成增多。这种改变增加了细胞膜的刚性和抗渗性，使得细胞膜对质子的渗透性降低，以对抗酸性条件下的质子涌入［7-8］。在酸适应阶段，其他乳酸杆菌中也存在类似的丙酮酸代谢改变的情况［9-10］。

Wu等［11］报道，在酸胁迫过程中，干酪乳杆菌体内8种参与碳水化合物代谢的蛋白表达上调，包括N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶(N-acetyl-glucosamine deacetylase，NagA)、氨基葡萄糖脱氨酶(glucosamine deaminase，NagB)、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡糖胺变位酶、乳酸脱氢酶、二磷酸硫胺素辅羧酶、半乳糖变旋酶和磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸转移酶。其中，NagA催化6-磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺和6-磷酸-D-果糖的代谢，而6-磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺是N-乙酰-D-葡糖胺和二磷酸尿苷(uridine diphosphate，UDP)-N-乙酰胞壁酸的前体，这2种物质是细胞壁肽聚糖生物合成所必需的，这表明这些酶的表达水平升高可能与膜受损后的修复有关。有研究推测，干酪乳杆菌中NagB的表达上调或许与细胞质pH的动态平衡有关。其他6种蛋白与糖酵解相关，这些蛋白的表达上调说明酸胁迫后的干酪乳杆菌糖酵解加强。Chen等［12］发现，酸胁迫后的干酪乳杆菌，其H+-ATP酶的表达升高，可以推测在酸胁迫过程中，干酪乳杆菌糖酵解加强，ATP合成增多;同时，H+-ATP酶利用ATP水解释放的能量将胞内质子运送出细胞，从而维持细胞质内外pH的动态平衡。对乳酸乳球菌的研究也发现了类似的现象［13］，NagB浓度的迅速升高使得乳酸乳球菌可以利用牛奶中的N-乙酰葡糖胺作为替代碳源诱导细胞内氨的产生，氨可以用于菌体内含氮分子的生物合成或者维持细胞质pH的动态平衡。

2 分子伴侣、氨基酸代谢及核糖体蛋白在酸耐受应答过程中的变化

Wu等［11］指出，干酪乳杆菌中热休克蛋白DnaK为酸诱导蛋白，在蛋白质的成熟、降解及修复中扮演重要角色。保加利亚乳杆菌的2种翻译延伸因子热不稳定延伸因子(elongation factor thermo unstable，EF-Tu)、延伸因子 G(elongation factor G，EF-G)在酸胁迫时表达上调，干酪乳杆菌中也存在类似的情况。除在蛋白质翻译中的作用外，EF-Tu、EF-G在蛋白质的折叠中具有类似于分子伴侣的功能，而且核糖体和氨酰tRNA-EF-Tu之间的相互作用对控制翻译的准确性具有重要作用［5］。EF-Tu、EF-G 在酸胁迫时的表达上调有利于保证酸胁迫环境下菌体内蛋白质合成过程中的准确翻译及正确折叠。

当细胞克服酸性环境时，细胞内氨基酸合成会受到限制，可能是由于这一过程中的ATP结合效率降低［14-15］。细胞内氨基酸浓度的降低可能会引起细胞通过其他途径来获取氨基酸，如通过肽酶(Pep)或者肽转运相关蛋白的过量表达途径。保加利亚乳杆菌的2种肽酶(PepN和PepO1)在酸胁迫时表达上调［5］，鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌等也存在同样的情况［10-11］。Sánchez 等［16］发现，长双歧杆菌在pH 4.8环境下，其PepP的表达水平高于pH 7.0环境下。在酸胁迫环境下，干酪乳杆菌中PepT、PepF、PepD3和PepN等几个肽酶的表达也被诱导［11］。Zhai等［5］推测这些肽酶可能会与Clp蛋白酶合作，降解酸胁迫导致的错误折叠的蛋白质，释放出氨基酸，然后循环利用生成新的蛋白质。

酸胁迫环境中，保加利亚乳杆菌的2种核糖体蛋白RpiM、RpsS表达水平升高，稳定生长期的干酪乳杆菌核糖体大亚基蛋白中L10的表达水平下调，小亚基蛋白中S2的表达水平上调［17］。核糖体蛋白被认为是热休克和冷休克的传感器［18］，可能也与酸耐受应答有关。

3 p H传感及自适应调节相关蛋白在酸耐受应答过程中的变化

一般而言，细菌相关信号转导系统感知环境的变化，这些信号刺激细胞内的各种反应机制，从而引发细菌代谢上的适应性变化。其中，由膜结合型传感器和细胞质内的调控效应子组成的双组分信号转导系统(two-component signal transduction system，TCSTS)对于细菌的适应和存活是必不可少的。保加利亚乳杆菌体内存在5个完整的TCSTS。在这些系统中，一种类似于VicK/VicR的信号转导系统可以感知酸胁迫并作出反应。酸性环境触发了VicK样受体及同源调控子VicR样蛋白的磷酸化，磷酸化的VicR样蛋白进而活化或阻遏pH应答基因的表达，进行自适应调节［5］。

此外，在乳酸菌对酸耐受应答的反应中，几种转录调控子在协调基因表达调控方面发挥重要作用，如参与碳水化合物代谢的CggR阻遏蛋白。另外，在保加利亚乳杆菌中，还发现一种潜在的未知功能的转录调控子Ldb0677参与酸耐受应答，该因子在酸适应阶段表达水平上调，Ldb0677的过度表达提高了细菌的酸耐受性。关于Ldb0677的具体调控过程及功能，还需要进一步研究。

4 小结

目前为止，益生菌的酸耐受应答可能的机制有质子泵、产生碱性物质、受损蛋白质的修复、受损DNA的修复、细胞膜成分的改变等［19］。而蛋白质组学分析是进一步了解这些机制的重要工具，对于提高益生菌的耐酸力，解决益生菌在胃肠道存活率偏低的现象具有十分重要的意义。

［1］ 陈卫，谭惠子，胡斌，等.益生菌对消化道胃酸和胆盐胁迫的应激机理［J］.中国食品学报，2010，10(6):1-6.

［2］ GOODSON M，ROEBURY R J.Habituation to normally lethal acidity by prior growth of Escherichia coli at a sub-lethal acid pH value［J］.Letters in Applied Microbiology，1989，8(2):77-79.

［3］ JAN G，LEVERRIER P，PICHEREAU V，et al.Changes in protein synthesis and morphology during acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(5):2029-2036.

［4］ 刘怀龙，孟祥晨，庄翘楚.益生菌酸性应激的研究进展［J］.食品工业科技，2008(6):300-303.

［5］ ZHAI Z Y，DOUILLARD F P，AN H，et al.Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus CAUH1 and functional identification of a novel acid stress-related transcriptional regulator Ldb0677［J］.Environmental Microbiology，2013，16(6):1524-1537.

［6］ SAUER U，EIKMANNSB J.The PEP-pyruvate-oxaloacetate node as the switch point for carbon flux distribution in bacteria［J］.FEMS Microbiology Reviews，2005，29(4):765-794.

［7］ FERNANDEZ A，OGAWA J，PENAUD S，et al.Rerouting of pyruvate metabolism during acid adaptation in Lactobacillus bulgaricus［J］.Proteomics，2008，8(15):3154-3163.

［8］ ZHANG Y M，ROCK C O.Membrane lipid homeostasis in bacteria［J］.Nature Reviews Microbiology，2008，6(3):222-233.

［9］ BROADBENT J R，LARSEN R L，DEIBEL V，et al.Physiological and transcriptional response of Lactobacillus casei ATCC 334 to acid stress［J］.Journal of Bacteriology，2010，192(9):2445-2458.

［10］ KOPONEN J，LAAKSO K，KOSKENNIEMI K，et al.Effect of acid stress on protein expression and phosphorylation in Lactobacillus rhamnosus GG［J］.Journal of Proteomics，2012，75(4):1357-1374.

［11］ WU R，ZHANG W，SUN T，et al.Proteomic analysis of responses of a new probiotic bacterium Lactobacillus casei Zhang to low acid stress［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，147(3):181-187.

［12］ CHEN X，YANG M，SUN Z H，et al.Molecular cloning and characterisation of alpha subunit of H+-ATPase in Lactobacillus casei Zhang［J］.Czech Journal of Food Sciences，2009，27(1):49-54.

［13］ EVEN S，LINDLEY N D，LOUBIÈRE P，et al.Dynamic response of catabolic pathways to autoacidification in Lactococcus lactis:transcript profiling and stability in relation to metabolic and energetic constraints［J］.Molecular Microbiology，2002，45(4):1143-1152.

［14］ POOLMAN B，DRIESSEN A J，KONINGS W N.Regulation of solute transport in streptococci by external and internal pH values［J］.Microbiological Reviews，1988，51(4):498-508.

［15］ BUDIN-VERNEUIL A，PICHEREAU V，AUFFRAY Y，et al.Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactococcus lactis MG1363［J］.Proteomics，2005，5(18):4794-4807.

［16］ SÁNCHEZ B，CHAMPOMIER-VERGÈS M C，DEL CARMMEN C M，et al.Low-pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum biotype longum［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(20):6450-6459.

［17］ WU R，WANG W，YU D，et al.Proteomics analysis of Lactobacillus casei Zhang，a new probiotic bacterium isolated from traditional home-made koumiss in Inner Mongolia of China［J］.Molecular ＆ Cellular Proteomics，2009，8(10):2321-2338.

［18］ JONES P G，MITTA M，KIM Y，et al.Cold shock induces a major ribosomal-associated protein that unwinds double-stranded RNA in Escherichia coli［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93(1):76-80.

［19］ 金君华，张昊，郭慧媛，等.乳酸菌酸胁迫应答机制研究进展［J］.中国乳业，2012(11):32-35.