细菌生物膜的基本特性研究进展

祝司霞

(攀枝花学院医学院，四川 攀枝花 617000)

自然界中，99.9%的细菌以生物膜形式存在[1]，细菌生物膜(biofilm，BF)是细菌为适应周围环境而形成的自我保护形式，它是与游走细胞相对应的存在形式，绝大多数细菌在进化过程中逐渐形成了精细的粘附机制，分泌基质并相互粘连形成膜状物附着于病灶表面，从而形成BF 的复杂团体。BF 与人类的生产生活密切相关，它可以粘附在人体组织器官表面，而且对抗生素和机体免疫力的抵抗能力大大增强，通常引起诸如慢性支气管炎、肺部感染、败血症、牙周病和心内膜炎等难治疾病；而且BF 还能牢固的粘附在医用材料上（动静脉导管，气管插管，导尿管，人工心脏瓣膜，人工关节等），导致医源性感染的发生和相关治疗的失败；此外，自来水管道、下水道、空调系统等与人类生活相关的设施也会污染BF 细菌，腐蚀工业管道，造成很大的经济损失[2]。因此，对BF 的研究已经成了医学、微生物学、环境科学当中的热点课题，下面对BF 的基本特性做一综述，以期能对疾病的治疗和环境的治理提供一定的理论依据。

1 生物膜的成份及其功能

BF 含有多种成分，其中水份含量可高达97%，此外，还含有细菌和细菌自身产生的胞外多聚物、吸附的营养物质和代谢产物、细菌裂解产物及环境中的特殊物质或碎屑等，它们的成分是蛋白质、多糖、核酸、肽聚糖、脂和磷脂等，约占BF 的2%～15%[3]。

BF 中的水或流动或固着在膜中。BF 中可含有纯种细菌，也可含有多种细菌，能分泌多种胞外物质，帮助BF 的形成。胞外多聚物，包括胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)和糖蛋白，多糖随细菌种类不同而不同，多高度分支，牢固地凝集在一起构成BF 的支架，也可作为某些细菌的营养物，对BF 中细菌的存活非常重要。BF 中膜整合蛋白居多，具高度的亲和性，能作为黏附剂。此外，还有调节蛋白，能调节某些特定基因表达，具有信号通路作用的信号分子和一些酶等功能蛋白。BF 中的代谢产物如细菌素、维生素、抗生素和噬菌体等，它们是菌体释放的，可以抵抗BF 外的其它异种菌群，或给细菌的生存提供足够的营养。有学者认为，BF 中的DNA 一部分是菌体死亡裂解被动释放的，作用不大；还有一部分是某些细菌生长到一定阶段表达自溶素，促进DNA 的主动分泌，这些DNA 能促进BF 的形成和稳定BF；另外，BF 中细菌易建立感受态，可摄取胞外DNA 进行转化，导致遗传性状的改变[4]。

2 生物膜的结构

目前，有两种典型的BF 结构模型：“异质镶嵌”模型，“蘑菇或郁金香”模型。“异质镶嵌”模型认为，胞外多糖把众多菌体聚集成许多的小叠状体，叠状体再联结成柱状物，外围环绕液体层。“蘑菇或郁金香”模型则认为，BF 中的细菌形成许多微菌落，膜顶比膜底宽，形似蘑菇或郁金香，微菌落之间有输水通路，水溶液不断的在通路中循环流动，能够输送营养和排出废物等，这种结构和功能类似原始的循环系统[5]。

有学者认为，模型化的BF 从外向内依次为：生物膜主体层(bulk of biofilm)、连接层(1inking film)、调节层(conditioning film)、基质层(substratum)。它的主要特点是BF 的结构存在着广泛的异质性，其深处和浅处的细菌体积大小和代谢活性均有显著差异，如产生不同的毒素，原因是细菌所处的pH 值和氧化还原电位等微环境不同，导致相同的细菌其基因表达模式不同，在BF 垂直方向不同层面的细菌RNA含量、蛋白质合成和呼吸活性均不同[6]。因此，不同细菌或同一细菌不同环境形成的BF 结构差异较大，可因种类、营养、附着的表面特性和环境条件不同形成疏松、致密或厚薄不等的BF 结构。

3 生物膜的形成

细菌形成BF 是一种本能，是表面生活时的一种生长方式，任何细菌在条件合适的情况下，都能形成BF，遗传改变可影响其形成BF的能力。BF 的形成和发展过程经历以下5 个阶段：

3.1 调节膜的形成

宿主提供BF 表面，是细菌在宿主体内形成细菌BF 的第1 步。BF的形成大多与植入体内的生物材料和自身组织病变有关。首先生物材料和自身病变组织提供BF 表面，随后唾液、血液、尿液、胃肠道液等含有机（主要是多糖和蛋白质）或无机营养物质的体液会在几分钟之内覆盖其上，这些覆盖于表面的体液形成一个2～10nm 的蛋白吸附层，叫做调节膜(CB)，而CB 表面的蛋白、糖蛋白、糖脂等作为特异受体可选择性地与细菌黏附[3]，最后细菌附着其上。

3.2 菌体粘附

细菌黏附是细菌对宿主BF 表面的黏附和菌体间的聚集过程。黏附对细菌BF 的形成至关重要，细菌黏附于表面可免于被流体带到不利于其生长的环境，例如，尿道中的大肠杆菌，牢固地附着在尿道内，免于被尿液冲出体外。最初细菌通过沉积、Brown 运动、经液体流动、细菌表面和调节膜间的静电吸引等进行可逆性的附着[7]。细菌还可以与机体组织、生物材料表面通过化学键发生受体和配体间特异性结合，因此黏附具有选择性和特异性。宿主组织表面的蛋白、糖蛋白和糖脂常可作为受体，选择性地吸附特定种类细菌表面特定的黏附素蛋白(adhesin)。

此阶段细菌BF 尚未成熟，抵抗力不强，对各种抗菌药物也相对敏感，抑菌或杀菌效果较好。

3.3 生物膜的发展

即众多微菌落的形成过程，微小的菌落，是BF 的基本组成单位。一方面大量游动菌体进一步黏附于已固着的菌体表面，另一方面已固着菌体大量生长繁殖，同时菌体分泌胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)显著增加，胞外多聚物（EPS）的大量表达是细菌附着后最重要的生长变化之一。这些多聚物提供了一个坚固而有黏性的骨架，相互交叉成长链，将细胞固定在一起，赋予生物膜以刚性与柔韧性。EPS 把细菌粘结成细菌团块，即微菌落(microcolony)。大量微菌落使BF 加厚[8，9]。此过程中，细菌为适应自然环境而产生一些新的特性，如BF 中细菌对抗生素抗性显著提高，给临床治疗带来一定的困难。

3.4 生物膜的成熟

即众多微菌落连接成大的扩散性结构的过程。当微菌落扩大到一定程度，BF 就进入了成熟阶段。大量微菌落使细菌BF 加厚，细菌BF趋于成熟。

此过程细菌通过细胞间黏附素（主要是胞外多糖）自我聚集，同时需要多种遗传因子参与，进行信号转导调控。研究发现菌体表面存在带有“接触感受器”的特定“兴奋区”，能对其所接触的物质表面进行检测、作出应答，启动特定基因的表达[9]。另外，细菌附着于表面后，进行生长、分裂、繁殖，其他游走细胞继续附着，最终导致该附着位点的细菌生长环境极度拥挤，有毒代谢产物积累，许多细菌营养物质缺乏，在这种竞争压力下，细菌启动胞间信号系统，产生胞间信号。目前学术界比较认可的是在细菌BF 的形成和成熟中有一种信息交流系统，其中密度感应系统(quorom sensing，QS)起着重要作用，QS 能根据自身所处环境或群体密度的变化来调节多种靶基因表达，如细菌密度改变或营养条件变化时，细菌表面产生和分泌某种特定信号分子，一般称为信息激素或自身诱导素，与调控蛋白(主动诱导子)或外激素结合构成复合物，这种复合物再与胞内特定的靶基因结合，从而激活或抑制这些基因的转录。这种机制能有效的促使菌体检测其自身种群的密度变化，避免细菌过度生长而造成空间和营养物质的缺乏[10]。目前已知有5类信息激素：酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine，AHI)、PQSs(heptylhydroxy，庚基羟基)、AL2、循环二肽(cyclic dipeptide)和寡肽(oligopeptide)[11，15]。其中高丝氨酸内酯是一种重要的生物膜内的信号传递分子，高丝氨酸内酯能促进BF 的三维空间结构的形成和维持，不产高丝氨酸内酯的缺陷型菌株紧紧包裹在一起的细胞，极易被十二烷基硫酸钠所破坏。

3.5 细菌播散

在内在的调节机制或在外部冲刷力等作用下，成熟的BF 中的部分细菌能从BF 脱离，如通过外力、波状迁移的物理运动、或者自我消解播散到其他环境，引起感染。细菌从BF 内游离出来，转变成浮游状态，寻求更适宜的生存环境，再黏附到合适的介质表面形成新的BF，形成游走细胞-细菌BF-游走细胞-细菌BF 的循环往复。有人研究，大肠埃希菌的BF 中，RNA 连接蛋白CsrA 是BF 分解的始动因子[12]。

4 生物膜的特点

4.1 移动性

BF 中的细菌大部分都固着于多聚物基质中，少数可自由移动，从膜中一个微菌落移动到另一个微菌落，也可脱离BF 进一步扩散，这种扩散可能是BF 对环境变化作出应答的结果[12]。如当细菌处于饥饿或其他不利条件下，细菌能分泌胞外多糖水解酶，水解胞外多糖，从BF 内游离出来，转变成浮游状态。

4.2 异质性

BF 深处和浅处的细菌体积大小和代谢活性均有显著差异，表明其结构存在着广泛的异质性[10]。BF 的形成是一个动态过程，由于BF中的细菌在不同时间和空间发展，扩大了细菌的生存环境，造成其基因表达和生理活性上的不均质性，BF 不同层面的细菌RNA 含量、呼吸活性和蛋白质合成均不同；同时遗传学上一致的细菌由于细菌所处微环境的pH 值和氧化还原电位等不同，可诱导其表达与浮游细菌不同的基因，常导致生理状态发生显著变化。处于BF 深层的细菌很难获得养分和氧气，代谢活性很低，而浅层的细菌则相反。因此，不均质性是细菌BF 的另一个重要特性，也与细菌的抗性有关。

4.3 复杂的结构和代谢

细菌BF 具有复杂的结构和代谢方式。BF 由胞外多糖交错成网状结构支架，表面附着互相粘连的菌体，BF 中具有孔道，类似原始的循环系统，可以运输营养和代谢产物。BF 一旦建成，细菌排列密集且其代谢转换为产生胞外多聚物，因此细胞代谢活跃，但是以很低的速度分裂[13]。而且由于BF 中的营养成分、代谢产物浓度、渗透压和氧浓度等，自外向内呈梯度下降，所以BF 外层或表层细菌生长快速，内层细菌生长缓慢。

4.4 难治性

4.4.1 抗吞噬性

包裹着细菌的黏性基质将细菌和机体免疫系统隔开，使机体的吞噬细胞和杀伤细胞及其所分泌的酶不能对细菌产生有效的杀伤，可以逃避宿主免疫作用；同时BBF 能减少细胞因子的产生或酶解细胞因子[14]。

4.4.2 耐药性

当细菌以BF 形式存在时耐药性明显增强(10～1000 倍)[14]。有效浓度的抗菌药物能迅速杀死浮游生长的细菌和BF 表面的细菌，但对BF深处的细菌却难以有效杀灭，但当细菌从BF 上脱落下来成为浮游菌后，很快又对抗菌药物恢复敏感。BF 的耐药机制不同于浮游菌，原因可能是多方面的：①BF 的黏质物屏障作用导致药物进入BF 受阻；②BF 中的细菌生长速度较浮游菌明显缓慢，尤其是BF 深层的细菌几乎处于休眠状态，而抗生素对快速生长细胞更有杀伤力；③当BF 内的细菌数量过多时，细菌密度感应系统(quorom sensing，QS)会使一部分细菌从BF 表面脱离，导致感染扩散或复发，引起临床症状；④BF 中基因表达改变，使BF 菌株的生物学行为也随之改变，导致耐药性的发生；⑤有的细菌能分泌抗生素分解酶，使之丧失抗菌效能，其中尤以β-内酰胺酶引起的耐药性最为重要；⑥许多细菌能产生抗生素外排泵，这种泵能够将穿过细菌外膜的抗生素及时排出细菌体外，从而避免了抗生素与细菌的接触；⑦激活应激反应，导致细菌的生理学改变，使其在各种环境下得到保护；⑧对抗机体免疫防御体制[13-14]。

4.4.3 粘附性

细菌BF 的形成过程是细菌与材料表面接触附着，在材料表面形成菌落，菌落生长包埋于胞外多糖基质中，有了BF 的保护，细菌就能抵抗清洗作用和消毒因子，造成清洗和消毒的失败。大量研究证实，细菌BF 中的粘性胞外多糖与医用材料(各种导管、人工瓣膜、起搏器、人工关节和隐型眼镜等)污染导致医院感染发生密切相关[15]。医用材料在治疗危重病患和慢性病患领域应用广泛，易于附着细菌，如不能及时消除可能形成BF，成为医院感染潜在因素。

4.5 胞间信号转导

细菌BF 的形成需要胞间信号的相互传递，在BF 内，细菌之间通过细菌的产物来实现信息传递，信号分子对细菌定植在已形成菌落或定植在竞争十分剧烈的环境表面起着十分重要的作用[9]；信号分子可以改变BF 内的种群分布，改变相邻细胞蛋白的表达，将某些遗传特性(如抗药性)传递给邻近细胞。

4.6 分裂缓慢

在一个成熟的BF 内，细胞很少或以很低的速度分裂。由于深层的细菌很难获得养分和氧气，代谢产物难以排出而堆积，菌体较小，不进行频繁的细胞分裂，此外BF 内细菌分裂受到周围多糖的限制。

4.7 细菌分布的规律性

BF 内细菌分布并不是简单杂乱无章的[8]。无论是单菌种还是多菌种组成的BF 内，细菌都不是随机分布的，而是按各自的最适生存需求所组成。

综上所述，细菌BF 与浮游细菌相比有许多不同的特性，且具有粘附、耐药、抗机体免疫的特点，给临床治疗带来很大的麻烦，所以早期发现易形成细菌BF 菌株，加强护理防止医用材料和人体组织上细菌BF 的形成至关重要。虽然关于细菌BF 基本特性的研究已经取得了初步进展，但在BF 的组成结构、形成机制和维持机制、BF 与机体免疫关系、耐药等方面仍有许多复杂的机制尚无定论，特别是与BF 形成调控有关的关键基因的克隆及表达，对BF 形成机制分子水平的研究，以及实验室用何种方法确定BF 的存在，都有待我们进一步研究发现。

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