淫羊藿苷脂固体质纳米粒制备工艺的优化及其体外释放研究

王安斌,李群芳,周旭美

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

淫羊霍，又称仙灵脾，为小檗科植物淫羊霍(Epimedium brevicormon Maxim ) 的全草，味辛、甘，性温，归肝、肾两经，是祖国传统医学中的一种补益中药，具有温阳补肾、强筋健骨、祛风除湿等功效[1]。淫羊藿苷(ICA)为淫羊藿所含黄酮类化合物的一种主要有效成分。现代药理研究表明，ICA具有广泛的生理活性，如增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢，此外具有补肾壮阳、抗衰老、抗肿瘤等功效[2-4]。对ICA相关理化性质研究表明[5]，ICA为水不溶性药物，当口服含ICA的相关药物时，ICA在胃中比较稳定，而当ICA到达肠道时会很快发生代谢，其口服生物利用度较低。 因此，本实验从制剂学角度，利用现代化的纳米载体技术对我国传统医学中药淫羊藿中的主要有效成分ICA进行新型制剂研究，采用单因素法优化处方，制备ICA纳米微粒。利用新型纳米材料作为药物载体材料，能有助于药物释放至有效血药浓度范围并能长时间地将血药浓度控制在该范围内，以减少给药次数，减轻患者痛苦。固体脂质纳米粒( solid lipid nanoparticle，SLN) 作为一种有前景的新型药物载体制剂，具有良好的生物组织相容性、稳定性、靶向性、可控制药物释放和毒性低等特性[6-8]，能有效地保护被包载药物不被胃肠道环境破坏并可达到控释和缓释的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪( 美国安捷伦公司)；色谱柱( 4.6×250mm，5μm，美国安捷伦公司)；TGL16M台式高速冷冻离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器( 郑州长城科工贸有限公司)；透析袋(截留分子量8000～14000，国药集团化学试剂有限公司) 。

1.2 试剂 ICA原料药( 纯度>98%，南京泽朗医药有限公司)；ICA对照品( 纯度>98%，中国药品生物制品检定所)；大豆卵磷脂(上海源叶生物科技有限公司)；胆固醇( 国药集团化学试剂有限公司)；泊洛沙姆188( 上海源叶生物科技有限公司)；PEG-2000(国药集团化学试剂有限公司):甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 淫羊藿苷固体脂质纳米粒(ICA-SLN)的制备[9-10]采用改进后的制备方法—超声分散与高温熔融-低温固化结合法制备ICA-SLN，将脂质材料与卵磷脂共同溶于无水乙醇中，超声30 min，再将药物与其混合加热至70 ℃使其溶解，作为有机相；将乳化剂溶于水，超声15 min，加热至70 ℃作为水相；用注射器将有机相加入到搅拌的水相中，使有机溶剂挥发，恒温搅拌乳化4 h；浓缩液分散到20 mL冰水中，超声30 min，冰浴搅拌1 h，即得ICA-SLN。

1.3.2 包封率及载药量的测定

1.3.2.1 色谱条件 流动相: 乙腈-水(30∶70)；体积流量：1.0 mL /min；进样量：20 μL；检测波长：270 nm; 温度：25 ℃。

1.3.2.2 包封率和载药量测定采用聚结离心法测定[11]取ICA-SLN 200 μL 溶解于1 mL甲醇中，涡旋1 min， 12 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样20 μL，HPLC 检测，计算药物总量，记为W总。取ICA-SLN 1 mL，加入200 μL 0.1 mol·L-1盐酸溶液，4℃冷藏过夜后，12000 r·min-1离心10min，取上清液测定，计算游离药物含量，记为W游。

包封率( %) = ( W总- W游) / W总× 100%

载药量( %) = ( W总- W游) / W脂× 100%

1.3.3 优选处方工艺 根据预试验的筛选及分析，本实验通过单因素法对处方进行逐一筛选,以包封率和载药量为验证指标，确定大豆卵磷脂、胆固醇、投药量、PEG-2000、F-68各指标的取值范围，从而得出较优处方配比。

1.3.4 体外释放特性 体外释放实验[12-13]，参照中国药典附录，分别取制备好的ICA-SLN与ICA溶液10 mL置于透析袋中，封好两端后置于盛有200 mL 释放介质的溶出杯中，以体积分数30%甲醇磷酸盐缓冲液(pH6.8) 为释放介质，在温度(37±0.5) ℃、转速为( 100±5)/min 条下透析，定时取样2 mL，并及时补充相应量同温度的溶出介质，经微孔滤膜( 0.45 μm) 过滤，用HPLC测定释放液中游离ICA的浓度，计算不同时间点药物的累积释放百分率，绘制累积释放曲线。

2 结果

2.1 淫羊藿苷标准曲线的制作 取Ica对照品适量，精密称定，用甲醇配成质量浓度为4.8、48、96、192、288、384、480μg /mL 的对照品溶液，精密量取20 μL，注入色谱仪，在上述色谱条件下进行测定，以峰面积( Y) 对浓度( X) 进行线性回归，等到标准曲线方程为y=37.442x+74.326。

2.2 处方优化单因素实验 按1.3.3项下的操作进行单因素优化实验，结果表明，由处方1～4，可知包封率与载药量随大豆卵磷脂用量的增加呈先增加后减小的趋势；由处方5～8，可知载药量随胆固醇用量的增加呈先增加后减小的趋势；由9～16，可知包封率随ICA原料药用量的不断增加在5～40 mg时有显著变化，随着ICA原料药用量的继续增加包封率变化不明显；由处方17～19，可知包封率与载药量随F-68用量的增加呈先增加后减小的趋势；由处方20～23，可知包封率与载药量随PEG-2000用量的增加呈先增加后减小的趋势。因此，确定了较优处方配比为: 大豆卵磷脂为500 mg，胆固醇为150 mg，ICA为60 mg，F-68为200 mg，PEG-2000的用量为80 mg(见表1)。

表1优化处方单因素实验

处方号卵磷脂(mg)胆固醇(mg)ICA(mg)PEG-2000(mg)F-68(mg)载药量(%)包封率(%)1300150 10 50 1000.9180.5 2500150 10 50 1001.286.4 3600150 10 50 1001.0484.1 4700150 10 50 1000.483.16 550050 10 50 1000.9478.5 6500150 10 50 1001.286.4 7500200 10 50 1001.1385.55 8500300 10 50 1000.8688.11 9500150 5 50 1000.4566 10500150 10 50 1001.286.4 11500150 20 50 1002.290.2 12500150 30 50 1003.4994.17 13500150 40 50 1004.394.6 14500150 50 50 1005.0695.18 15500150 60 50 1005.7995.9 16500150 80 50 1009.496.8 17500150 60 50 1005.7995.9 18500150 60 50 2006.4797.27 19500150 60 50 3004.695.9 20500150 60 50 2006.4797.27 21500150 60 80 2006.5998.23 22500150 60 100 2006.594.3 23500150 60 150 2006.3793.12

2.3 优化处方的验证实验 由优化的处方按“1.3.1”项下方法，制备了3批ICA-SLN样品，并按”1.3.2”项下方法测定样品的包封率及载药量。结果表明所选优化处方，所制备3批样品ICA-SLN包封率及载药量的测定值较稳定。因此可知，由改进后的制备方法及所选优化处方所制备ICA-SLN的成功率较高且较稳定(见表2)。

表2优化处方的验证实验

样品号包封率(%) 载药量(%) 1 97.93 6.51 2 98.23 6.59 3 98.06 6.32x±s98.07±0.156 6.47±0.139

2.4 体外释放实验 按“1.3.4”项下方法进行体外释放实验，结果表明，ICA在30%的甲醇PBS溶液中一直以较快速度释放，9 h内累积释放率达到99.97%；而ICA-SLN在30%的甲醇PBS溶液中，8 h前释放速度较快，8 h后以较为缓和的速度释放逐渐趋于匀速释放，72 h内累积释放率达到89.75%(见图1)。

图1 ICA与ICA-SLN的体外释放百分曲线

3 讨论

本实验采用了改进后的制备方法——超声分散与高温融溶低温固化结合法制备ICA-SLN，该方法在原有高温融溶低温固化的方法上加入了超声法，利用了超声有助于物质分散的特点，一方面能使有机相和水相在高温熔融步骤更好的融合，另一方面也能使形成的脂质体在低温固化步骤能够更好的分散开。从而，制备出具有较高包封率和载药量的ICA-SLN。通过对该处方所制备的ICA-SLN进行测定，得到包封率为98.23%，载药量为6.59%，与单一的高温融溶低温固化制备法相比，该方法所制备ICA-SLN有较高包封率、载药量及较好缓释效果。而且通过验证实验可知该制备方法稳定性较好。

处方优化上，本实验预实验通过正交法来优化设计处方，预实验结果并不理想，较难得到较优处方。因此，本实验采用了单因素逐个筛选的方法制备ICA-SLN，再结合包封率与载药量作为评判指标对处方进行优化，选取较优处方。最后得到较优处方为：大豆卵磷脂为500 mg，胆固醇为150 mg，ICA为60 mg，F-68为200 mg，PEG-2000为80 mg。

通过对ICA与该优化处方所制备出的ICA-SLN进行体外释放实验，结果表明，所制备的ICA-SLN与ICA相比具有更好的缓释效果。由图1可知，ICA从释放开始便以较快的速度释放，在短时间内便完全释放。而ICA-SLN开始释药时存在一个突释现象，主要的原因可能是因为一些未被包载的药物吸附在纳米粒子的表面，因此在体外释放初期这部分药物便以较快的速度释放到介质中；另一种原因可能是由于部分纳米粒子的破裂及部分乳化剂被同时包裹于脂质骨架表层中，也导致了药物的突释现象。待释放一段时间，释药速度逐渐缓慢，之后便以较为恒定的速度释放，此阶段即是被包载药物的释放。因此，ICA-SLN完全释放需要较长时间，其充分的展现了所制备ICA-SLN的缓释效果。

本实验采用了改进后的制备方法——超声分散与高温融溶低温固化结合法制备ICA-SLN；还探讨了关于单因素法的方法较正交法更适合本实验筛选出较优处方；且筛选优化出的较优处方，通过改进后制备法所制备的ICA-SLN与单一高温融溶低温固化制备法相比，改进后制备法所制备的ICA-SLN具有较高包封率、载药量及较好的缓释效果，由处方优化验证实验可知改进后的制备方法制备ICA-SLN成功率较高。然而该纳米制剂在体内能否也具有同样的缓释效果，仍需进一步实验证明。

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