吡那地尔后处理对缺血/再灌注大鼠离体心脏超微结构的影响

王 颖，张永国，侯伟波，王海英，喻 田

(遵义医学院 麻醉系， 贵州 遵义 563099)

经皮腔内冠脉血管成形术、冠脉搭桥术虽能使缺血心肌重新获得血流供应而挽救生命，但伴随着强烈的氧化应激反应，加重心脏损伤，即为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。吡那地尔为吡啶氰胍类非选择性钾通道开放剂，能预防和减轻心肌缺血症状，缩小心肌梗死面积[1-3]，对缺血再灌注心肌起到保护作用。本研究通过采用langendorff离体心脏灌注系统，从微观角度观察，吡那地尔后处理对缺血/再灌注离体大鼠心脏的超微结构及线粒体评分的影响，为深入研究吡那地尔后处理心肌保护机制提供依据，为临床应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 年龄为15～18周健康雄性SD大鼠，250～300g，8～9周龄，清洁级(第三军医大学大坪医学院动物中心提供，证书号：SCXK(渝)2012-0005)。

1.2 实验试剂 吡那地尔(Sigma公司，美国)；Krebs-Henseleit灌注液(K-H液)：(单位 mmol /L)NaC1 118.0、KC1 4.7、KH2P041.2、MgSO41.2、NaHCO325.0、CaC121.25、Glucose 10.0；Tomas停跳液：(单位 mmol /L) NaC1 118.0、KC1 4.7、NaHCO325.0、CaC121.25、MgCl2·6H20 219.08(国产分析纯)。

1.3 实验仪器 BS224S 电子天平(sartorius公司，德国)；去离子水处理器(Milli QA，美国)；CyberScan 310型pH计(优特EUTECH 新加坡公司，美国)；powerlab生物信号采集系统、langendorff 离体心脏灌注系统(澳大利亚)；透射电子显微镜(日立H7500日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立模型 将麻醉后(肝素 250/kg、1%戊巴比妥钠 40 mg /kg，腹腔)大鼠固定，迅速开胸取心脏置于K-H液中(4 ℃，pH 7.35～7.45)，排除血液，固定主动脉于Langendorff灌注针，充氧后K-H液(37 ℃，pH 7.35～7.45)持续逆行灌注，剪开肺动脉降低肺动脉压，去除左心耳，将球囊传感器沿左心房插入左心室固定，调整灌注压在70～80 mmHg，左室舒张末压在4～8 mmHg，平衡20 min后，心率>250次/min、左室发展压≥80 mmHg、室性早搏≤2个/min，建模成功。

1.4.2 实验分组 将24个成功模型随机分为4组，每组6只：正常组(N) 持续K-H液灌注120 min；缺血/再灌注组(I/R) K-H液20 min，缺血40 min，再灌注60 min；缺血后处理组(IPO) K-H液20 min，缺血40 min，缺血与再灌注10s反复交替2 min，再灌注58 min；吡那地尔后处理组(Pi) K-H液20 min，缺血40 min，Pi 2 min，再灌注58 min。

1.4.3 制备电镜标本 实验结束后，迅速取左心室不同部位组织，将其切为1×1×1(mm)大小，取5～8块置于含有2.5%戊二醛固定液的EP管中(4 ℃)，以上操作需在2 min内完成。4 ℃冰箱固定2h，进行固定、脱水及包埋，将超薄切片置于透射电子显微镜下观察10个视野并拍照。

1.4.4 线粒体评分 每个电镜标本随机选择5个视野，每个视野随机选择20个线粒体，使线粒体总数达100个，采用Flameng评分标准[4](见表1)，将观察到的每个线粒体损害程度按0～4级，分别计为0～4分，最后将100个线粒体所得总分除以100，既为该标本得分，分数越高，表示线粒体损伤越重。

表1线粒体Flameng评分标准

分级线粒体损害程度评分0级线粒体结构正常,充满颗粒0分1级线粒体结构正常,但颗粒缺乏1分2级线粒体肿胀,基质透明2分3级线粒体嵴分裂,伴基质透明和浓聚3分4级基质丢失,线粒体嵴分裂,线粒体4分内膜和外膜完整性缺失,呈空泡状

2 结果

2.1 超微结构 各组心肌细胞超微结构改变(见图1)，N组心肌细胞(见图1A)结构完整，肌丝排列整齐，可见Z线、M线清晰，胞浆中富含球形、卵圆形线粒体，脊密集，排列整齐。I/R组心肌细胞(见图1B)损害严重，可见细胞内外明显水肿，核膜破裂，肌丝大面积溶解，Z线溶解，线粒体肿胀，脊断裂、溶解呈空泡样变，肌质网扩张。IPO组、Pi组心肌细胞(见图1C、图1D)损害较I/R组轻，可见肌丝稀疏，部分溶解，排列基本整齐，线粒体结构完整，部分轻度肿胀，脊排列整齐。

A: N组；B: I/R组；C: IPO组；D: Pi组。图1 各组心肌细胞超微结构(标尺2μm，× 20000)

2.2 线粒体评分 采用线粒体Flameng评分法，对各组大鼠心肌组织线粒体评分，结果显示(见表2)

分组线粒体评分N0.220±0.042I/R3.760±0.043*IPO1.280±0.045*&Pi1.210±0.041*&#

与N组比较*P<0.05，与I/R组比较&P<0.05，与IPO组比较#P=0.247。

3 讨论

线粒体是心肌细胞氧化功能的主要场所，当心脏发生缺血/再灌注时，线粒体可产生大量活性氧(ROS)，使线粒体膜磷脂、呼吸链蛋白产生强烈的氧化损伤，导致氧化磷酸化障碍，造成线粒体结构及功能损伤，从而损害心肌。心脏缺血后处理可维护线粒体膜内部的完整和线粒体膜电位的稳定、减少线粒体内ROS的产生，保护线粒体呼吸链功能，从而减轻心肌缺血再灌注损伤[5-6]。ATP敏感性钾通道对实现上述细胞保护作用至关重要，用线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂可废除上述心肌保护效应[7-9]。吡那地尔为吡啶氰胍类非选择性钾通道开放剂，可同时开放线粒体ATP敏感性钾通道及细胞膜ATP敏感性钾通道，改善缺血心脏功能。本课题组前期通过检测基因表达，采用RT-PCR及Western blotting法，观察到吡那地尔后处理可模拟缺血后处理对离体心脏灌注的心功能产生一定的保护作用[10-11]，50μmol/L为吡那地尔产生心肌保护作用最佳浓度。

本研究结果显示，电镜下N组心肌细胞结构完整，I/R组心肌细胞损伤严重，细胞明显水肿，核膜破裂，肌丝大面积溶解，Z线溶解，线粒体肿胀，脊断裂、溶解呈空泡样变，肌质网扩张。IPO组及Pi组心肌细胞损伤程度相似，均介于N组与I/R组之间。4组心肌细胞进行线粒体评分，可见N组明显低于I/R组，IPO组及Pi组评分相似，且均介于N组与I/R组之间。说明IPO组及Pi组对心肌缺血/再灌注损伤均有保护作用，且吡那地尔后处理避免了缺血后处理反复钳夹血管等不利因素，可操作性强，因此，吡那地尔后处理可能具有更好的优势。

综上所述，本研究从细胞形态学方面证实了缺血后处理及吡那地尔后处理可减轻缺血/再灌注所致心肌细胞超微结构损害，降低线粒体评分，可能产生心肌保护作用。

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