通窍益心丸促血管生成作用的实验研究

傅晓东++林锦培++陈伟华

【摘要】目的：建立鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型并探讨中药通窍益心丸干预对血管生成作用的影响。方法：本实验采用血清药理学的方法制备药物血清并建立鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型，鸡胚随机分为空白血清组、VEGF组及通窍益心丸大、小剂量组，干预后检测鸡胚绒毛尿囊膜的血管增生程度。结果：通窍益心丸小剂量组CAM的血管增生数与空白血清组相比有明显差异（P<0.05），而通心络大剂量组的血管增生数不仅与空白组有显著差异（P<0.01），且与VEGF组无明显差异（P>0.05）。结论：通窍益心丸能够促进鸡胚绒毛尿囊膜的血管增生，并呈剂量依赖性，具有一定的促血管新生作用。

【关键词】血管生成；鸡胚绒毛尿囊膜；通窍益心丸

[Abstract]Objective：The stimulate angiogenesis effect of TongQiaoYiXin Tablet on the chick embryo chorioallantoic membrane（CAM）model were studied.Methods：38 chick embryo（CE）were randomly divided into 4 groups，9 CE in group A were treated with vacuity blood serum as negative controls，10 CE in group D were treated with VEGF（vascular endothelial growth factor）as positive controls，9 CE in group B and 10 CE in group D were treated with micro-dose and maxims of TongQiaoYiXin herbal serum respectively.After 3 days of incubated，counting the first and second grade vessels and angiogenesis area.Results：the proliferation of vessels and angiogenesis area group B was obviously increase than group A（P<0.05）and group C was obviously increase than group A（P<0.01），but group C has no obviously difference controlled with group D（P>0.05）.Conclusions：TongQiaoYiXin Tablet could stimulate angiogenesis of the CAM model and showed good protective on myocardial ischemia.

[Key Words]angiogenes；chorioallantoic membrane（CAM）；TongQiaoYiXin Tablet

血管新生（angiogenesis）是指在原有的毛细血管和/或微静脉基础上通过血管内皮细胞的迁移和增殖，从已存在的血管处以芽生或非芽生（套迭）形成新的，以毛细血管为主的血管系统过程[1]。冠心病现代医学认为是一种由于冠状动脉狭窄或闭塞导致心肌缺血，进而影响心功能的临床常见的心血管疾病，介入治疗对部分患者有应用限制且疗效仍有待提高[2]。而冠脉侧枝血管的形成和开放能部分缓解心肌的缺血，改善患者的临床症状与预后，近年来研究主要集中在药物治疗，尤其是中药干预以加强新生侧枝血管的自然过程从而维持冠状动脉渐进性闭塞时的血流量，即治疗性血管增生以减轻心肌缺血逐渐成为目前研究的热点[3]，因此本实验拟通过鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型探讨中药通窍益心丸干预对血管生成作用的影响。

CAM模型建立：参照付生法等研究方法改良[5]。选取发育良好的白皮种蛋，用温水清洗2次并消毒后放入37℃孵化箱，气室向上，每天转动3～4次，孵蛋直至第9天后取出，首先将种蛋表面进行消毒，而后在超净工作台中将气室顶端打一个约1～2mm的小孔，并在距胎头前1cm处、两条前卵黄静脉之间的卵壳投影部位，75%酒精消毒后沿着长方形区域的边线磨切透卵壳，切勿损伤下方的卵壳膜，继而在卵壳膜上轻轻划开一个直径约1mm的小孔，滴加无菌蒸馏水少许，让液体浸入卵壳膜与CAM之间，使得鸡胚的尿囊绒毛膜与鸡蛋的卵壳膜分离，选择无菌微孔滤膜载体，用打孔器制成直径5mm的圆片。并将其放在CAM的血管最为稀少的地方，同时在载体中央滴加之前配置好的各组相对应的血清（滴加的液体量为10μl/每蛋）。加药后使用无菌透明胶封窗并做好标记，放入37.8℃的孵箱内持续孵育3天。3天后每个种蛋注入混合固定液2.5ml（甲醇、丙酮1：1等量混合），置于室温下固定20分钟，待CAM的血管内血液完全凝固后，用眼科镊揭去封窗的透明膜，同时剪除CAM水平以上的蛋壳，以滤膜载体为中心把CAM剪下，置入盛有少量蒸馏水并铺有滤纸的平皿里展开，阴干后连同滤纸保存。采用解剖显微镜观察，凡属趋向性生长的血管，即以载体为中心发出，与滤膜半径的夹角小于45度者均予计数，而穿行、绕行的血管则不算在内。实验部位边缘（即微孔滤膜载体边缘）1mm范围内为一级血管，实验部位边缘5mm处为二级血管，一、二级血管以相同放大倍数分别观察计数。

讨论

治疗性血管新生于2000年在美国心血管年会上提出，是指利用血管新生促进因子刺激局部血管新生，形成有效的侧支循环，有助于改善动脉粥样硬化时心脏与外周动脉狭窄导致局部供血不足。已知的促血管新生因子有成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血管生长素1（angiogenin-1，ANG-1）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等[7]，由于目前研究采用促血管新生因子治疗冠心病仍处于临床实验阶段，尚有诸多问题需要解决，诸如给药途径、起效时间及安全性等。

多项研究发现部分中药单体具有影响血管新生的作用[8]，但与临床普遍采用中药复方治疗的情况脱节。而中药复方的研究则更为复杂和困难，因为其是多种药物的有机组合，体现的是经生物体自身消化和吸收所形成的综合作用，即进入体内后所发生的一系列代谢变化，因此中药复方药理的体外研究往往和体内实验存在一定的差距，因此我们采用血清药理学的方法以求能够模拟中药经体内代谢后的作用[9]，使实验结果能够最大限度与临床相仿。

血管新生的体外模型目前比较公认的是鸡胚尿囊膜（CAM），因其方法较简便，计数指标在实验研究中客观成熟并具有良好的重复性，能够定性、定量检测不同成份及生物因子等对血管的促进或抑制作用，在应用CAM进行定量分析时，以往多采用计数给药周围血管数的方法，由于存在对新生血管定义不清，人工计数可重复性较差等问题，我们在采用计数的同时，运用Image-pro plus 6.0软件进行血管新生面积的测算，由于其可只对特定区域内的血管进行统计，具有精确、客观、可重复记算等优点，通过两种方法互相配合可以更客观地反映实验结果。

通窍益心丸是国家保护品种，由麝香、牛黄、蟾酥、珍珠、冰片、三七等组成，多年临床应用证明其具有活血化瘀，益气强心，通窍止痛等作用，其组成药物中有多味已被证实具有促进血管新生的作用；本实验研究提示中药复方通窍益心丸能够促进血管生成，呈剂量依赖性，大剂量组疗效与VEGF相仿，表明通窍益心丸可能通过促进血管生成，从而达到改善供血不足导致的疾病，为临床应用提供实验依据。进一步的工作希望能通过心肌缺血动物模型及临床循证医学研究以明确其对冠心病患者能促进血管新生，有效建立侧枝循环的疗效。（本工作得到上海舜百生物工程公司的大力协助，特此致谢！）

参考文献

[1]Jiang C，Lu H，Vincent KA，et al.Gene expression profiles in human cardiac cells subjected to hypoxia or expressing a hy-brid form of HII-1 alpha[J].Physiol Genomics，2002，8（1）：23-32.

[2]Ross R.Cell biology and atherosclerosis[J].Ann Rev Physiol，1995，（57）：791-804.

[3]王培利，雷燕，陈可冀.血管新生-治疗心血管疾病的新策略[J].中国中西医结合杂志，2006，26（2）173-176.

[4]刘平，周建锋，胡义扬，等.益气养阴诱导SMMC-7721肝癌细胞分化作用与意义[J].中国中医基础医学杂志，2000，6（8）：29-34.

[5]付生法，陆应麟，张朝山，等.检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术[J].军事医学科学院院刊，1993，（17）：294-296.

[6]李玉娟，段昌令，李鸿海，等.丹酚酸B对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生作用的影响[J].沈阳药科大学学报，2010，27（11）：905-907.

[7]范维琥.麝香保心丸治疗性血管新生的临床研究[J].中国社区医师，2006，22（4）：46.

[8]陈文元，吴立娅，陈岩，等.中药影响血管新生作用机制研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2009，15（3）：237-239.

[9]Sakae Amagya，Kazumichi，Akira Miyake，et al.A new pharmacological testing method-Different effects of levamisole and the serum of mice orally treated with levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccharide[J].J Chem Pharm Bull，1989，37（4）：1117-1119.

多项研究发现部分中药单体具有影响血管新生的作用[8]，但与临床普遍采用中药复方治疗的情况脱节。而中药复方的研究则更为复杂和困难，因为其是多种药物的有机组合，体现的是经生物体自身消化和吸收所形成的综合作用，即进入体内后所发生的一系列代谢变化，因此中药复方药理的体外研究往往和体内实验存在一定的差距，因此我们采用血清药理学的方法以求能够模拟中药经体内代谢后的作用[9]，使实验结果能够最大限度与临床相仿。

血管新生的体外模型目前比较公认的是鸡胚尿囊膜（CAM），因其方法较简便，计数指标在实验研究中客观成熟并具有良好的重复性，能够定性、定量检测不同成份及生物因子等对血管的促进或抑制作用，在应用CAM进行定量分析时，以往多采用计数给药周围血管数的方法，由于存在对新生血管定义不清，人工计数可重复性较差等问题，我们在采用计数的同时，运用Image-pro plus 6.0软件进行血管新生面积的测算，由于其可只对特定区域内的血管进行统计，具有精确、客观、可重复记算等优点，通过两种方法互相配合可以更客观地反映实验结果。

通窍益心丸是国家保护品种，由麝香、牛黄、蟾酥、珍珠、冰片、三七等组成，多年临床应用证明其具有活血化瘀，益气强心，通窍止痛等作用，其组成药物中有多味已被证实具有促进血管新生的作用；本实验研究提示中药复方通窍益心丸能够促进血管生成，呈剂量依赖性，大剂量组疗效与VEGF相仿，表明通窍益心丸可能通过促进血管生成，从而达到改善供血不足导致的疾病，为临床应用提供实验依据。进一步的工作希望能通过心肌缺血动物模型及临床循证医学研究以明确其对冠心病患者能促进血管新生，有效建立侧枝循环的疗效。（本工作得到上海舜百生物工程公司的大力协助，特此致谢！）

参考文献

[1]Jiang C，Lu H，Vincent KA，et al.Gene expression profiles in human cardiac cells subjected to hypoxia or expressing a hy-brid form of HII-1 alpha[J].Physiol Genomics，2002，8（1）：23-32.

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[8]陈文元，吴立娅，陈岩，等.中药影响血管新生作用机制研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2009，15（3）：237-239.

[9]Sakae Amagya，Kazumichi，Akira Miyake，et al.A new pharmacological testing method-Different effects of levamisole and the serum of mice orally treated with levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccharide[J].J Chem Pharm Bull，1989，37（4）：1117-1119.

多项研究发现部分中药单体具有影响血管新生的作用[8]，但与临床普遍采用中药复方治疗的情况脱节。而中药复方的研究则更为复杂和困难，因为其是多种药物的有机组合，体现的是经生物体自身消化和吸收所形成的综合作用，即进入体内后所发生的一系列代谢变化，因此中药复方药理的体外研究往往和体内实验存在一定的差距，因此我们采用血清药理学的方法以求能够模拟中药经体内代谢后的作用[9]，使实验结果能够最大限度与临床相仿。

血管新生的体外模型目前比较公认的是鸡胚尿囊膜（CAM），因其方法较简便，计数指标在实验研究中客观成熟并具有良好的重复性，能够定性、定量检测不同成份及生物因子等对血管的促进或抑制作用，在应用CAM进行定量分析时，以往多采用计数给药周围血管数的方法，由于存在对新生血管定义不清，人工计数可重复性较差等问题，我们在采用计数的同时，运用Image-pro plus 6.0软件进行血管新生面积的测算，由于其可只对特定区域内的血管进行统计，具有精确、客观、可重复记算等优点，通过两种方法互相配合可以更客观地反映实验结果。

通窍益心丸是国家保护品种，由麝香、牛黄、蟾酥、珍珠、冰片、三七等组成，多年临床应用证明其具有活血化瘀，益气强心，通窍止痛等作用，其组成药物中有多味已被证实具有促进血管新生的作用；本实验研究提示中药复方通窍益心丸能够促进血管生成，呈剂量依赖性，大剂量组疗效与VEGF相仿，表明通窍益心丸可能通过促进血管生成，从而达到改善供血不足导致的疾病，为临床应用提供实验依据。进一步的工作希望能通过心肌缺血动物模型及临床循证医学研究以明确其对冠心病患者能促进血管新生，有效建立侧枝循环的疗效。（本工作得到上海舜百生物工程公司的大力协助，特此致谢！）

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[1]Jiang C，Lu H，Vincent KA，et al.Gene expression profiles in human cardiac cells subjected to hypoxia or expressing a hy-brid form of HII-1 alpha[J].Physiol Genomics，2002，8（1）：23-32.

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[5]付生法，陆应麟，张朝山，等.检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术[J].军事医学科学院院刊，1993，（17）：294-296.

[6]李玉娟，段昌令，李鸿海，等.丹酚酸B对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生作用的影响[J].沈阳药科大学学报，2010，27（11）：905-907.

[7]范维琥.麝香保心丸治疗性血管新生的临床研究[J].中国社区医师，2006，22（4）：46.

[8]陈文元，吴立娅，陈岩，等.中药影响血管新生作用机制研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2009，15（3）：237-239.

[9]Sakae Amagya，Kazumichi，Akira Miyake，et al.A new pharmacological testing method-Different effects of levamisole and the serum of mice orally treated with levamisole on mitogenic activity of lipopolysaccharide[J].J Chem Pharm Bull，1989，37（4）：1117-1119.