绞股蓝总苷对血管性痴呆小鼠海马组织神经元损伤及pCREB表达的影响

罗灿兰，田 虹，秦 伟，陈远寿

(遵义医学院 生理学教研室，贵州 遵义 563099)

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是一种由出血、缺血、缺氧性脑血管病引起的以痴呆为主要表现的慢性渐进性智能障碍综合征[1]。它严重影响人们的生活质量，可VD造成的学习记忆功能障碍的具体机制还不十分明确，临床上的治疗方法目前效果欠佳。文献发现，cAMP反应元件结合蛋白(CREB)活性的激活及变化与树突棘的可塑性和学习记忆功能有关，而磷酸化CREB(pCREB)是CREB的活化形式，位其下游的大量基因如即刻早基因、脑源性神经营养因子等基因的转录均受其调节，也参与了神经元生存过程，以及学习记忆等重要作用[2-3]。绞股蓝能否通过改变pCREB的表达量来影响小鼠的学习记忆功能还未知。近来有研究报道，绞股蓝总苷(Gprostemma Pentaphyllum Makino,GP)在缺血性脑损伤中能清除自由基、抗脂质过氧化，抑制钙超载、减轻线粒体损伤，建立脑动脉侧支循环、增加脑血流量，增强神经活性作用[4-5]，对血管性痴呆的空间记忆和长时程增强有改善作用[6]，显示绞股蓝总苷可能有神经保护作用。我们先前的研究也证实绞股蓝总苷可明显改善VD小鼠的学习记忆能力[7-8]。然而绞股蓝改善血管性痴呆所致的学习记忆功能障碍的具体机制目前尚不清楚。为此，本研究拷贝小鼠血管性痴呆模型，观察血管性痴呆小鼠以及绞股蓝治疗的VD小鼠海马神经元损伤和海马组织pCREB mRNA表达变化情况，以探讨绞股蓝改善血管性痴呆小鼠学习记忆功能及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器 绞股蓝总皂苷(含量>90%)，购于东宇药业有限公司；水合氯醛粉剂，中国医药集团上海化学试剂公司提供；RNA抽提试剂、逆转录试剂盒、PCR用混合荧光引物，均由大连宝生物工程有限公司提供；苏木精，成都贝斯特试剂有限公司提供。CM1800冰冻切片机，德国徕卡公司生产；荧光显微镜，日本Olympus生产；Icycler荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司生产；Tu-1810紫外分光光度计，北京通用分析仪器公司生产；Centrifuge5415D离心机，德国Eppendof公司生产；BeckMAN coulTER离心机，美国贝克曼公司生产。

1.2 实验动物与分组 C57BL/6G 清洁健康雄性小鼠90只，体重22～25g，5周龄，采购于重庆第三军医大野战外科研究所医学实验动物中心，许可证号：SCXK-(军)2002008。适应性喂养5 d后随机将雄性C57BL小鼠80只分为5组：假手术组(Sham组)、血管性痴呆模型组(VD组)、血管性痴呆+绞股蓝处理组(GP低、中、高剂量组)，每组16只。每组实验动物又分24、72 h进行观测。

1.3 制备血管性痴呆模型与给药 运用反复夹阻小鼠2侧颈总动脉致缺血-再灌注制作血管性痴呆模型。术前小鼠禁食8 h ，不禁水。腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100g麻醉，仰卧位固定，备皮后消毒颈正中切口，小心地钝性分离左、右侧颈总动脉，避开颈动脉窦及神经用小动脉夹夹双侧颈总动脉使颈总动脉阻闭，造成脑缺血10 min，放开动脉夹再灌注20 min，如此反复3次。术后保持室内温度26 ℃。假手术组小鼠同法麻醉后分离2侧颈总动脉，仅穿线，不阻断血流。

术前3 d及术后24、72 h的每天早晨分别给绞股蓝处理组小鼠腹腔注射1次绞股蓝皂苷稀释液(低、中、高剂量：100、200、400 mg/kg) 。VD模型组及假手术组腹腔注射等容积生理盐水，疗程及次数与GP处理组相同。

1.4 脑组织HE染色 将小鼠称重后予10%水合氯醛0.35 mL/100g腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪开上腹部并夹紧剑突向上翻，暴露及剪开胸腔隔膜，打开胸腔且暴露心脏。轻轻将注射器针头从左心室插入主动脉，止血钳固定针头，剪开右心耳，先灌注0.9%生理盐水50 mL，接着灌注4%多聚甲醛50 mL，见小鼠尾部变硬并翘起。迅速断头，小心地取出完整脑组织，放置于4%多聚甲醛进行后固定，4 ℃过夜，分别予4 ℃15%、30%蔗糖依次脱水，每次均沉底。将修饰好的脑组织放入卡诺氏固定液中固定后依次进行洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(组织厚6 μm)、贴片，烘干贴好组织的载玻片后进行脱蜡复水，苏木精染色15 min后依次水洗、分色、漂洗、脱水、复染(0.5%伊红乙醇)、再脱水、透明、封片。

1.5 pCREB表达的检测

1.5.1 样品采集与处理 小鼠断头处死后在冰盘上迅速取脑，取出左、右侧完整海马，将两侧海马放于盛有0.5 mL trizol的EP管中，-80 ℃冻存。取50 mg冻存的海马组织，依次进行解冻，匀浆，离心，萃取，沉淀，空干，提取出总RNA，紫外分光光度计测定总RNAA260/A280的值在1.8～2.0，说明RNA质量好，逆转录成cDNA，-20 ℃保存备用。RT-PCR反应测定海马组织pCREB的含量。

1.5.2 pCREB mRNA的表达测定 环腺苷酸反应元件结合蛋白基因序列根据基因库并用Primer 5.0分析软件设计得到，再磷酸化成磷酸化环腺苷酸反应元件结合蛋白。用同一软件设计内参基因β-actin 与CREB。定量PCR 引物序列及反应条件(见表1)。运用RT-PCR 方法检测海马组织pCREB mRNA的表达水平。

表1基因引物序列及反应条件

基因名称 引物序列 产物片段/bp退火温度/ ℃β-actin上游 TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC下游 GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC14957pCREB上游 TGGCTAACAATGGTACGGATGG下游 CTGGGCACTAGAATCTGCTGTCC13359

2 结果

2.1 绞股蓝对血管性痴呆小鼠海马神经元损伤的影响 造模后72h海马组织HE染色显示，假手术组海马CA1区锥体神经细胞数目多，排列紧密、整齐，细胞结构完整，细胞核为椭圆形或圆形(见图1A)；血管性痴呆模型组海马CA1区锥体神经细胞多见片状坏死，其数目减少明显，细胞排列杂乱，细胞核边界模糊、多固缩(见图1B)；血管性痴呆+绞股蓝低剂量处理组锥体神经细胞数目稍多，层次排列整齐(见图1C)；血管性痴呆+绞股蓝中、高剂量处理组海马CA1区锥体神经细胞数目增多，少见明显片状坏死，细胞结构较清晰、排列较紧密、整齐，少见细胞核固缩(见图1D、E)。

注：A：假手术组；B：模型组；C～E：绞股蓝处理组(低、中、高剂量组)；(HE×400)。图1 绞股蓝干预72h后对血管性痴呆小鼠海马组织神经元损伤的影响

2.2 海马组织pCREBmRNA的表达情况 与假手术组比较，VD 模型组海马组织 pCREBmRNA 的表达水平均显著降低(P<0. 05)；与VD模型组相比，血管性痴呆+绞股蓝低、中、高剂量处理组海马组织pCREBmRNA 表达量均明显增加，差异有统计学意义 (P<0. 05) ；血管性痴呆+绞股蓝低、中、高剂量处理组间差异无统学意义(P>0.05)，pCREBmRNA的表达量呈递增趋势(见表2) 。结果表明绞股蓝总苷可使血管性痴呆小鼠海马组织pCREB的表达量提高，并且在短期内低、中、高剂量间无明显量效关系。

组别 剂量(mg/kg)24h72h假手术组_1.58±0.041.66±0.04模型组_1.43±0.06*1.31±0.03*低剂量组1001.69±0.03#1.46±0.04#中剂量组2001.70±0.05#1.50±0.10#高剂量组4001.71±0.08# 1.51±0.32#

注：与假手术组比：*P< 0.05；与模型组比：#P< 0.05。

3 讨论

反复脑缺血再灌注后，可诱导某些对缺血敏感的脑区神经元细胞即早基因快速表达，从而导致神经元细胞的凋亡，是造成血管性痴呆(VD)的主要原因之一。研究发现，海马组织CA1区是缺血缺氧最为敏感的区域，最易发生神经元选择性迟发型死亡，而海马区组织的神经细胞凋亡会导致动物或患者的认知功能障碍，造成学习记忆减退，乃至发生痴呆[9-12]。本实验采用c57BL6/G小鼠反复夹闭2侧颈总动脉3次以拷贝VD模型，组织学结果发现，VD模型组小鼠海马CA1区锥体神经元细胞数目明显减少，呈片状坏死，与文献报道一致[1,11]。提示，反复脑缺血再灌注后海马神经元细胞死亡可能是小鼠发展成VD的原因之一。

本实验结果显示：与VD模型组小鼠比较，绞股蓝处理组小鼠海马CA1区锥体神经细胞数目增多，细胞结构较清晰、排列较紧密、整齐，少见细胞核固缩及细胞脱落坏死。结果表明，绞股蓝对海马神经元损伤有保护作用。

为进一步研究绞股蓝对神经元损伤的保护机制，本实验研究了与学习记忆相关的关键分子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)。早期研究发现缺失CREB的突变型小鼠空间学习记忆功能受损明显[13]。而磷酸化的CREB(pCREB)才能与cAMP反应元件结合，诱导下游基因转录，参与神经元的生长过程，对学习记忆有重要作用[2-3]。pCREB的水平变化可影响神经元突触的可塑性与学习记忆能力[2-3]。正常小鼠经过水迷宫训练后可提高学习能力，且测定海马组织pCREB的含量增高[14]。本实验结果显示，VD 模型组海马组织 pCREB mRNA 的表达水平比假手术组均显著降低；绞股蓝低、中、高剂量处理组海马组织pCREB mRNA 表达量比VD模型组均明显增加，差异显著。本课题组先前的实验证实，绞股蓝可明显改善VD小鼠的学习记忆能力[7]。提示，刺激VD小鼠海马CREB的转录活性可能是绞股蓝发挥神经保护及其促进学习记忆作用的机制之一。

综上所述，本实验结果证实，绞股蓝总皂苷可保护VD所致的小鼠海马CA1锥体神经元损伤，提高VD小鼠学习记忆能力，其机制可能与上调海马CA1锥体神经元pCREB mRNA 表达有关。这为探讨绞股蓝总皂苷的神经保护作用和提高学习记忆能力的分子机制补充了新的实验依据和思路。

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