羽衣甘蓝SSR反应体系的优化

刘畅+祝朋芳+房霞+康耀海+赵颖

摘要：为优化羽衣甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）ＳＳＲ反应体系，并利用优化的体系进行引物的筛选。采用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平，并采用Ｌ１６（４５）正交设计进行试验优化，建立了羽衣甘蓝ＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系。结果表明，各因素不同水平浓度对扩增结果均有一定影响，羽衣甘蓝基因组ＤＮＡ的最佳ＳＳＲ反应体系为ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ，总体积１０ μＬ。检测了优化体系的稳定性，利用优化的反应体系对芸薹属植物 ２０对ＳＳＲ引物进行扩增并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，在所选用的２０对引物中，１８对扩增出了清晰的条带，１１对具有特异扩增条带，多态性引物比率为６１％，验证了该体系可用于羽衣甘蓝ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增和ＳＳＲ引物的筛选。

关键词：羽衣甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）；ＳＳＲ；正交设计；体系优化

中图分类号：Ｓ６３５．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）09－2079-04

Optimizing SSR System of Brassica oleracea var. acephala

ＬＩＵ Ｃｈａｎｇ１，ＺＨＵ Ｐｅｎｇ－ｆａｎｇ１，ＦＡＮＧ Ｘｉａ１，ＫＡＮＧ Ｙａｏ－ｈａｉ１，ＺＨＡＯ Ｙｉｎｇ１，２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｕｒｂａｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１２２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＳＳＲ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｒａｎｄｏｍ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌ１６（４５） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｆａｃｔｏｒ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ（５０ ｎｇ／μＬ） １．０ μＬ， １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ１．０ μＬ， ２．０ μｍｏｌ／Ｌ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ３．０ μＬ ｅａｃｈ， ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ， Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ） ０．２ μＬ ａｎｄ ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ． Ｔｗｅｎｔｙ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｅｉｇｈｔｅｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｈａｄ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｅｌｅｖｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ６１％． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＳＳＲ－ＰＣＲ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ； ＳＳＲ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ； ｓｙｓｔｅｍ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

羽衣甘蓝（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）是十字花科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）芸薹属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）观赏植物，又名叶牡丹，观赏价值高，耐寒性强。开展羽衣甘蓝遗传育种相关研究工作是其应用的关键，由于我国近十几年才开始引种栽培羽衣甘蓝，目前较多的研究集中在组织培养及主要园艺性状的初步遗传规律分析等方面。

分子标记技术目前已成为现代遗传学研究的重点，在诸如ＳＲＡＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ等诸多分子标记中，ＳＳＲ标记基于ＰＣＲ，操作安全简单，多态性好，稳定性强，且多数为共显性［１，２］，是优良的基因组特异标记类型，近年来在芸薹属植物上得到了较广泛的开发。近缘属植物相关研究中，ＳＳＲ标记主要集中在油菜、甘蓝、白菜等作物中，目前尚未见羽衣甘蓝ＳＳＲ反应体系优化的相关研究。关于植物分子标记反应体系优化方面的研究，国内以采用正交试验获得最优反应体系较多［３－１１］。为此，在前人相关研究的基础上，对羽衣甘蓝ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系进行了研究，得到了一套适合于羽衣甘蓝基因组ＤＮＡ扩增的反应体系，为后续相关研究奠定了基础。

１材料与方法

１．１材料

以羽衣甘蓝自交系为试材。ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋）、Ｄ２０００ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ等分子生物学试剂购于天根生化科技有限公司。采用ＣＴＡＢ法［１２，１３］提取羽衣甘蓝基因组ＤＮＡ， 用１％的琼脂糖凝胶检测ＤＮＡ质量，－２０ ℃保存用于ＰＣＲ扩增。

１．２ＳＳＲ扩增反应体系的优化

ＳＳＲ引物根据芸薹属基因库信息源（ＢＲＡＤ，ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ．ｏｒｇ）公告的芸薹属作物引物序列，由金斯瑞生物工程技术有限公司合成。

ＳＳＲ反应体系总体积１０ μＬ，包括５０ ｎｇ／μＬ的模板ＤＮＡ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ，２ μｍｏｌ／Ｌ的引物，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ及５Ｕ／μＬ的Ｔａｑ聚合酶。为了确定这５个因素在ＰＣＲ反应中的最佳水平，采用单因素完全随机试验和正交试验，运用引物ＢＮ１２Ａ进行扩增。引物ＢＮ１２Ａ序列：５′端Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＧＣＣＧＴＴＣＴＡＧＧＧＴＴＴ

ＧＴＧＧＧＡ－３′， Ｔｍ：４９．５９ ℃； ３′端Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＧＡＧＧＡ

ＡＧＴＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＡ－３′，Ｔｍ：５２．３７ ℃。单因素完全随机试验选取了5个因素，各因素均设４个水平，逐个优化其他反应成分的水平，以确定相对较优的因素组合。该部分试验中，逐一研究反应体系中１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ及引物的用量对扩增结果的影响。即当针对某种组分进行试验时，其他组分的用量不变。

Ｌ１６（４５）正交试验因素与水平见表１，ＰＣＲ反应正交试验设计见表２。

１．３扩增产物和反应体系稳定性的检测

ＳＳＲ反应程序为：９４ ℃预变性３ ｍｉｎ，９４ ℃变性４５ ｓ，４０～５５ ℃（需根据Ｔｍ值确定）复性４５ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，３５个循环；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ；４ ℃保存。扩增反应结束后，在扩增产物中加入４ μＬ ＰＣＲ产物和１ μＬ ６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ混匀，２．０％的琼脂糖凝胶检测。或上样４ μＬ于５％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，在１×ＴＢＥ的电极缓冲液中电泳检测，采用银染法染色。

选用２０对ＳＳＲ引物优化后的最佳反应体系、反应程序进行ＳＳＲ反应体系稳定性检测。

２结果与分析

２．１羽衣甘蓝基因组ＤＮＡ质量检测

将提取的羽衣甘蓝基因组ＤＮＡ经分光光度计检测，发现其ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ nｍ均在１．８～２．０之间，又经１％琼脂糖凝胶电泳检测，ＤＮＡ呈现一条亮带，条带清晰，无明显的拖尾现象（图１），说明提取的ＤＮＡ纯度均一。纯度和浓度检测结果相互验证，说明提取的ＤＮＡ合格，可以满足后续的ＰＣＲ反应要求，为下一步的ＰＣＲ扩增筛选ＳＳＲ引物提供了有力的保障。

２．２羽衣甘蓝ＳＳＲ反应体系的优化

２．２．1单因素完全随机试验筛选结果由图2 可知，ｄＮＴＰｓ的体积在０．４～０．８ μＬ时扩增效果比较好，可扩增出清晰的条带，其中以０．８ μＬ的ｄＮＴＰｓ扩增出的特异性条带最多且最清晰。当ｄＮＴＰｓ体积达到１．０ μＬ时扩增出的条带很少且很浅不清晰，可能是由于高浓度ｄＮＴＰｓ易与Ｔａｑ酶竞争，结合了Ｍｇ２+，降低了酶活性；而ｄＮＴＰｓ浓度低时，影响扩增产物形成，扩增量少，条带较弱。

从图3可以看出，ＤＮＡ模板量在０．５～１．０ μＬ时，对ＳＳＲ的扩增没有明显的影响，但１．０ μＬ的ＤＮＡ模板扩增出的条带要比０．５ μＬ的ＤＮＡ模板扩增出的特异性条带多且清晰。但当ＤＮＡ模板量大于１．５ μＬ时，ＳＳＲ扩增结果出现了非特异性的扩增条带且杂带较多。

从图4可以看出，Taq DNA聚合酶的体积为0.1 μL时特异性条带很淡，在0.2~0.4 μL时扩增的带型较稳定且清晰。而当Taq DNA聚合酶的体积为0.6 μL时出现了较淡的非特异性条带。

从图５可以看出，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ的体积在１．０～１．５ μＬ时条带较清晰明显，但１．０ μＬ的１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ的特异性条带要比１．５ μＬ的亮。相反，当１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ体积大于２．０ μＬ时，扩增结果出现了较淡的非特异性条带。

从图６可以看出，当引物量较低（小于２.0 μＬ）时扩增出的条带很少，当引物量在２．５~3.0μＬ时扩增出的条带较多，尤其引物量为３.0 μＬ时扩增出的条带更清晰。由此应选用３.0 μＬ左右的引物用量。

２．２．2正交试验结果按照表２的１６个组合进行ＰＣＲ反应后的电泳结果见图7。从图7可以看出，在１６个处理组合中，由于Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ和引物５个因素的用量不同， 扩增的效果存在明显的差异。组合１、２基本没有条带，组合３、４、６、１２条带较少且较淡，组合５条带最多且很清晰。为了能扩增出清晰度高、稳定性强的条带， 选用组合５为最佳反应体系，即ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ， ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ。

综合单因素完全随机试验和正交试验的结果，认为适合羽衣甘蓝基因组ＤＮＡ的最佳ＳＳＲ反应体系为：ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／ μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ１．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ。

２．３ＳＳＲ反应体系稳定性的检测

采用分辨率更高的聚丙烯酰胺凝胶，利用上述构建的最优反应体系，在所选用的２０对引物中，１８对引物能扩增出清晰的条带（图8），筛选出具有特异扩增条带的ＳＳＲ引物１１对，多态性引物占有率为６１％。由此认为，上述建立的ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系稳定性较好，适合于羽衣甘蓝基因组ＤＮＡ的扩增。

３小结与讨论

ＳＳＲ体系的优化是以其ＰＣＲ扩增能力为尺度对模板ＤＮＡ或其他因素进行调整，从而获得最佳的扩增能力。ＳＳＲ－ＰＣＲ对反应条件的变化比较敏感，外界因素的不同会使ＳＳＲ的扩增结果不同。ＰＣＲ反应是由耐高温的Ｔａｑ酶催化，但不同公司生产的不同质量的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的扩增效果会有一定差异，从而导致Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的最佳用量也不会完全一样。试验中所用的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶为天根生化科技有限公司生产，从一定程度上保证了关键因子的一致性。在ＳＳＲ扩增反应中Ｍｇ２＋主要来源于Ｂｕｆｆｅｒ，由于本研究所采用的与Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶配套，使用的１０×Ｂｕｆｆｅｒ中已含ＭｇＣｌ２， 因而Ｍｇ２＋浓度被固定，并未对其中所含的Ｍｇ２＋的最适宜浓度进行研究，这与前人的研究有所不同。

试验中除Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ和引物等主要因素外，所使用的仪器、试剂、操作手法等因素也会对反应体系造成影响。为保证试验结果的可靠性，是在一致的试验条件下完成的，一定程度上保证了反应体系的统一和稳定性，从而有利于提高试验结果的可靠性，为后续试验如多态性引物筛选、特异性标记的获得等打下了坚实的基础。

ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的获得主要以单因素、完全试验、正交试验３种方法为主。相比较而言，单因素获得的反应体系方法简单易行，需进行多次的单因素梯度试验，忽略了各因素间的交互作用。完全试验考虑到了所有的组合方式，但试验组合数较多，工作量较大，费时费力。多因素的正交设计试验，利用正交表的均衡分散性和整齐可比性，既能减少试验规模又能快速地找出最优的反应体系，是筛选ＰＣＲ反应的一种有效方法［１３－１５］。试验首先用单因素完全随机试验大范围识别SSR反应体系中的关键影响因素的用量，再利用正交设计确定其最适用量。单因素完全随机试验的单因素因子不会影响其他因子评价，但也不能兼顾各因素间的交互作用，所以需先用单因素完全随机试验大范围确定影响因素的用量再用正交试验确定其最佳用量。试验采用了单因素试验和正交试验两种方法，但对于结果的判断通过直观的电泳图谱进行定性或评分法对各处理体系进行筛选也存在一定的主观性，因此也缺乏一定的可靠性。

在获得最佳反应体系后，要检测反应体系的稳定性以验证反应体系是否为最佳。试验继而选用２０对引物，利用以上优化后的反应体系进行扩增反应，获得了９０％的扩增率。此外，利用不同的ＳＳＲ引物检测多态性时，由于不同引物的Ｔｍ不同，因而采用的最适Ｔｍ也不同，试验中可参考引物设计合成时的退火温度或通过梯度ＰＣＲ仪筛选引物的最佳退火温度。试验建立的一套完善的适用于羽衣甘蓝的ＳＳＲ标准体系，将有助于为羽衣甘蓝重要性状分子标记的相关研究奠定基础。

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