快立洁手消毒凝胶的微生物限度检查方法学验证

檀巧婷，严 佳，周 欣，宋洪涛 (南京军区福州总医院药学科，福建 福州 350025)

快立洁手消毒凝胶是本院自主研发制剂，临床上用于外科洗手消毒、手卫生消毒以及一般皮肤消毒。根据《中国药典》2010年版二部规定，凝胶剂必须做微生物限度检查。建立该制剂微生物限度检查法时，应进行细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该制剂的细菌、真菌及酵母菌数的测定[1]。该凝胶中含有三氯生、乙醇等抑菌成分，进行微生物限度检查时应降低或消除其抑菌作用。经查阅相关资料和文献[2-6]，对于抑菌活性强的制剂，微生物限度检查多采用薄膜过滤法，因此采用薄膜过滤法建立快立洁手消毒凝胶微生物限度检查方法。

1 试验材料

1.1样品 快立洁手消毒凝胶(批号20121112)，由南京军区福州总医院制剂室提供。

1.2试验菌种 试验用菌均由福建省药检所提供，分别是：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；大肠杆菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]；白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(F)10104]。

1.3培养基及稀释液 营养肉汤培养基(批号 101213)、营养琼脂培养基(批号110325)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号110401)、改良马丁培养基(批号1011282)、改良马丁琼脂培养基(批号 1010272)、胆盐乳糖培养基(批号1012012)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号101201)、溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基(批号101124)和pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号 120329 )均由北京三药科技开发公司提供。

1.4仪器 隔水式电热恒温培养箱(型号：GHP-9160)、电热恒温鼓风干燥箱(型号：DHG-9145A)、无菌检查仪(型号：WJ-6)、净化工作台(型号：SW-CJ-1B)、真菌培养箱(型号：MJPS-150)、立式压力蒸汽灭菌器(型号：LDZX-40KBS)。

2 验证方法

按照《中国药典》2010年版二部附录XI J微生物限度检查法，进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

2.1菌液和供试液制备

2.1.1菌液制备 分别取经35 ℃培养24 h后的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物，以及26 ℃培养48 h的白色念珠菌新鲜培养物，用9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液依次10倍稀释至10-7；取经26 ℃培养7 d后的黑曲霉新鲜培养物，用5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，吸出孢子悬液，再10倍递增稀释。以上菌悬液同时取2份注入琼脂培养基培养，采用平皿法计数，得到所需菌落数(50～100 CFU/ml)的菌液稀释级。

2.1.2供试液制备 取样品1 ml，置于100 ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇，使其均匀分散，作为1:100供试液，备用。

2.2回收率测定

2.2.1结果判断标准 试验组的菌回收率(%)=[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%

稀释剂对照组的菌回收率(%)=(稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌数)×100%

2.2.2细菌、真菌计数方法验证 ①试验组：取供试液1 ml，注入薄膜过滤器，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，冲洗3次，每次100 ml，在最后一次的冲洗液中加入试验菌菌悬液1 ml(50～100 CFU/ml)，过滤后取出滤膜，菌面朝上贴于相应琼脂培养基上，培养观察。②菌液组：操作同试验组，仅加菌液。③供试品对照组：操作同试验组，仅加供试液。④稀释剂对照组：取稀释液1 ml替代供试液，操作同试验组。

表1 细菌、真菌计数方法验证试验结果(n=3)

由表1可见：回收率均大于70%，结果符合药典要求。

2.3控制菌检查方法的验证[7]

2.3.1试验组 铜绿假单胞菌：取供试液1 ml，注入过滤器中，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，冲洗3次，在最后一次冲洗液中加入试验菌1 ml(50～100 CFU/ml)，过滤，取出滤膜，接种至100 ml的胆盐乳糖培养基中，培养24 h。取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养24 h，观察结果。金黄色葡萄球菌：同铜绿假单胞菌培养方法，取出滤膜，接种至100 ml的营养肉汤培养基中，培养24 h，取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养72 h，观察结果。

2.3.2菌液组 铜绿假单胞菌：过滤器中先注入少量缓冲液，再注入菌悬液各1 ml(50～100 CFU/ml)，不加供试液，过滤(同2.3.1试验组操作)。金黄色葡萄球菌：同上述铜绿假单胞菌培养方法，过滤

后取出滤膜置于营养肉汤培养基中，培养、划线(同2.3.1试验组)。

2.3.3供试品对照组 同试验组，加供试液，不加菌液。

2.3.4稀释剂对照组 取与供试液等量的稀释剂与供试品组同法操作，作为阴性对照。

表2 控制菌检查方法验证试验结果

3 讨论

3.1样品具有抑菌作用，根据凝胶微生物限度检查方法的文献报道[2-6]，采用薄膜过滤法，能有效降低或消除抑菌作用，检查结果符合要求。在验证试验过程中，供试品分别制成1:10，1:20，1:50的供试液时，薄膜过滤缓慢，滤膜易堵，试验菌生长不规则，甚至不生长，菌回收率低于70%，不符合药典要求。试验最终选取1:100供试液，菌落生长良好，薄膜过滤较为顺畅，菌回收率均高于70%，验证结果符合要求。

3.2微生物限度检查的整个步骤相当复杂，相关程序特别多，在检测的过程中，任何的检测程序中的操作不当和硬件条件不够，都会对药品微生物限度检查结果造成不同程度的影响，从而导致误差的出现[8]。

4 结论

经验证试验，采用薄膜过滤法对样品进行细菌、真菌、酵母菌检查及控制菌检查，将样品制成1:100供试液，用pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 ml，试验菌回收率及控制菌检查结果均符合《中华人民共和国药典》规定。因此，在此试验条件下，采用薄膜过滤法建立快立洁手消毒凝胶微生物限度检查有效可行。

【参考文献】

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2010年版二部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录Ⅺ J108.

[2] 江 燕，张春瑛，钱文忠. 红花油凝胶微生物限度检查方法的验证[J].中国药师，2010，13(4)：591-592.

[3] 李近磊，王嘉怡，迟丹怡，等. 复方克林霉素凝胶微生物限度检查法的方法验证研究[J].中国药房，2010，21(25)：2380-2382.

[4] 杨淑先，赵新霞，牛 坡. 林可霉素利多卡因凝胶微生物限度检查方法研究[J].中国药房，2011，22(33)：3143-3145.

[5] 钱文静，张 玫，袁耀佐. 盐酸特比萘芬凝胶微生物限度检查方法的验证[J].药物分析杂志，2008，28(12)：2135-2139.

[6] 刘 宁，张文婷. 克林霉素磷酸酯凝胶微生物限度检查方法的验证[J].药物分析杂志，2007，27(12)：1991-1993.

[7] 周国华，傅小英. 医疗机构制剂检验基本操作指南[M]. 北京：人民军医出版社，2012：112-121.

[8] 李佩蓉，范秋汝. 药品微生物限度检验的误差影响因素[J]. 北方药学，2011，8(3)：81-119.