参麦注射液对急性胰腺炎大鼠的治疗作用及其机制研究

岑峰 严强 张国雷 倪俊 袁文斌 魏云海

急性胰腺炎(AP)早期存在微循环障碍，这些微循环的变化与胰腺病变的严重程度及血液中胰酶升高的水平呈正相关[1-2]。参麦注射液具有抑制内皮素-1的表达与释放、抑制血小板聚集、抑制血栓素合成、促进前列环素产生等作用，因此具有改善局部微循环，增加血管通透性及抗氧化等药理作用。本研究应用参麦注射液治疗急性水肿性胰腺炎(acute edematous pancreatitis, AEP)大鼠，观察AEP大鼠微循环及炎症反应的变化，探讨其相关机制，为临床应用参麦注射液提供实验依据。

材料与方法

一、实验动物及分组

健康成年雄性SD大鼠(由浙江省医学科学院提供)60只，日龄80～90 d，体质量(200±50)g。按完全随机法分为参麦治疗组(参麦组)和AEP组，每组30只。实验前禁食12 h，自由饮水，称重后采用雨蛙素50 μg·kg-1·h-1连续7次腹腔内注射、每次间隔1 h的方法建立大鼠AEP模型。造模后1 h给予5%水合氯醛0.35 g/kg体质量腹腔注射诱导麻醉，继以0.1 g·kg-1·h-1维持麻醉。参麦组从尾静脉内缓慢滴注参麦注射液(5 ml·kg-1·d-1)进行治疗；AEP组给予等容积生理盐水缓慢滴注。造模前1 d和造模后1 h及1、3、5、7 d眼内眦交替采血，每次2 ml。7 d时处死两组大鼠各15只，14 d处死剩余大鼠，留取胰腺组织样本备用。另选取正常大鼠3只，留取胰腺组织备用。

二、方法

1．血清淀粉酶、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)测定：采用ELISA法检测血清淀粉酶、PAF、VEGF的含量，试剂盒购自上海劲马生物科技有限公司，按说明书操作。

2．胰腺组织NF-κB mRNA及蛋白表达检测：应用总RNA快速提取试剂盒(Generay公司)抽提胰腺组织总RNA。采用实时RT-PCR方法检测NF-κB mRNA表达量。NF-κB引物正义序列为ACGGGGAAGGTCTGAATGC，反义序列为GGTGTCGTCCCATCGTAGGT，产物223 bp；内参GAPDH正义序列为AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，反义序列为AGGGGCCATCCACAGTCTTC，产物258 bp。引物的设计和合成由上海英骏生物有限公司完成。逆转录试剂盒购自Fermentas公司；qPCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad公司。mRNA相对表达量采用2-△△Ct公式计算。

取新鲜胰腺组织，裂解制备组织匀浆，离心取上清。蛋白定量后行常规蛋白质印迹法检测NF-κB蛋白表达量，以β-actin为内参。兔抗鼠NF-κB、β-actin一抗， 山羊抗兔IgG二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。以目的条带与内参条带的灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。

3．胰腺组织微血管密度(micro vessel density, MVD) 计数：胰腺组织固定后，常规石蜡包埋、切片，采用SP法检测CD31的阳性表达。参照Weidner等[3]方法量化计算MVD。每张切片先在低倍镜下寻找血管高密度集中的区域，然后在高倍镜(×250)下选取5个视野计数MVD。任何一个与周围其他组织有明显界限、胞质呈棕染的单个内皮细胞或内皮细胞簇，无论有无管腔、无论管腔内有无红细胞均定义为一个微血管；凡管腔直径>8个红细胞或管壁有明显肌层及纤维硬化、炎症及坏死的微血管均不计入总数。取5个视野的平均值作为该标本的MVD。

三、统计学处理

结 果

一、两组大鼠死亡率

大鼠造模后7 d内均无死亡，7～14 dAEP组死亡4只，参麦组死亡3只，死亡率分别为13.3%和10.0%，两组差异无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)。

二、血清淀粉酶、PAF、VEGF含量的变化

两组大鼠造模后1 h血清淀粉酶活性及PAF、VEGF含量即升高，较术前的差异均有统计学意义(t值分别为178.258、158.258、11.258，P值均<0.01)。造模后3、5、7 d参麦组血淀粉酶活性及PAF含量逐渐下降，且较AEP组下降显著，两组的差异均有统计学意义(t值分别为37.195、9.916、8.276、4.106、7.570、10.780，P<0.05或<0.01)；血清VEGF含量逐渐升高，且较AEP组升高显著，两组的差异均有统计学意义(t值分别为2.356、3.357、11.241，P<0.05或<0.01，表1)。

表1 参麦组和AEP组大鼠制模前后血清淀粉酶、PAF、VEGF含量的变化

三、两组大鼠胰腺组织NF-κB表达量的变化

正常胰腺组织NF-κB mRNA表达量为0.169±0.012。造模后7、14 d AEP组胰腺组织NF-κB mRNA表达量分别为1.000±0.059、0.762±0.047，参麦组为0.834±0.031、0.438±0.024；AEP组NF-κB蛋白表达量分别为0.93±0.45、0.44±0.20，参麦组为0.49±0.24、0.21±0.11(图1)。参麦组的表达均较AEP组显著降低，差异具有统计学意义(t值分别为9.646、21.097、3.341、3.458，P值均<0.05)。

图1 参麦组和AEP组大鼠胰腺组织NF-κB蛋白的表达

四、两组大鼠胰腺组织的MVD

CD31阳性表达定位于胰腺组织血管内皮细胞胞质，呈棕黄色(图2)。术后7、14 d参麦组大鼠胰腺组织的MVD分别为6.41±1.14、9.03±2.55，AEP组分别为3.62±0.89、3.22±1.92，参麦组显著高于AEP组，差异具有统计学意义(t值分别为7.471、6.127，P值均<0.01)。

讨 论

大量研究表明，AP发病机制与胰酶自身消化、微循环障碍、胰管屏障的破坏、氧自由基、炎症递质及多种细胞因子的作用相关，而胰腺炎从局部病变迅速发展为全身炎症反应综合征和多器官衰竭可能与细胞因子网络和免疫功能紊乱相关[4]。随着对AP微循环障碍认识的深入，通过改善微循环可以减轻胰腺细胞的损伤和坏死，进一步减轻胰腺炎时全身多脏器微循环障碍，同时阻止多器官功能衰竭综合征的发生和发展[5]。

图2 AEP组7、14 d(a、b)及参麦组7、14 d(c、d)大鼠胰腺组织CD31的表达(免疫组化染色 ×250)

PAF是一种强效生物活性磷脂，具有促进血管通透性增加、血小板活化、氧自由基大量释放等作用，从而导致血栓形成，微循环障碍，加重组织损伤。大量实验研究证实，PAF在AP的发病过程中起着重要作用，PAF的表达量与AP病情严重程度呈正相关[6-7]。VEGF是血管新生中最重要的刺激因子，能特异性地促进血管生成。

NF-κB在调节机体免疫炎症反应中起重要作用。NF-κB的过度活化会激活、增强机体的非特异及特异性免疫反应，造成组织损伤和器官功能紊乱。Telek等[8]认为，AP早期腺泡细胞氧自由基大量形成并造成细胞损伤与NF-κB的激活密切相关。Kim等[9]应用抗氧化剂治疗AP后能够抑制腺泡细胞NF-κB的活性，减少炎性细胞因子的产生，减轻腺泡细胞损伤，表明活性氧在介导刺激物激活NF-κB的过程中起重要作用，抗氧化剂可作为NF-κB抑制剂。参麦注射液是由人参与麦冬精制而成的纯中药制剂，其有效成分为人参皂苷和人参多糖。参麦注射液可增强内皮细胞释放血管舒张因子以扩张血管、增加血流，并促进血管生成以改善微循环，还可减少炎症递质的释放，抑制炎症因子活性，减轻炎症反应，此外，还具有抗氧化功效，因此，本研究采用参麦注射液治疗AEP大鼠，探讨其治疗AP的作用机制。

本研究结果显示，AEP造模后大鼠血清PAF、VEGF含量升高，胰腺组织NF-κB基因表达及MVD增加。参麦注射液治疗后大鼠血清PAF含量、胰腺组织NF-κB mRNA和蛋白表达量及MVD均较AEP组显著下降，而VEGF含量较AEP组显著升高，表明参麦注射液治疗AEP大鼠具有改善组织微循环，促进血管新生，缓解急性炎症反应，促进胰腺炎病程恢复的作用。

参 考 文 献

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[3] Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al. Tumor angiogenesis: a new significant and independent prognosis indicator in early-stage breast carcinoma[J]. J Natl Cancer Inst, 1992,84(24):1875-1887.

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[5] 于洪亮，郑荣哲，杨维良. 重症急性胰腺炎微循环障碍的治疗现状[J]. 国际外科学杂志，2007,10(34):685-688.

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[9] Kim H, Seo JY, Roh KH, et al. Suppression of NF-kappa B activation and cytokine production by N-acetylcysteine in pancreatic acinar cells[J]. Free Radic Biol Med, 2000, 29(7): 674-683.