多效唑对青钱柳苗木生理特性的影响1)

郭 楠 张颖颖 刘娜娜 谢寅峰 方升佐

(南京林业大学，南京，210037)

多效唑对青钱柳苗木生理特性的影响1)

郭 楠 张颖颖 刘娜娜 谢寅峰 方升佐

(南京林业大学，南京，210037)

以3年生青钱柳(Cyclocaryapaliurus)苗木为试材，采用叶面喷施法研究不同质量浓度的多效唑(PP333)对青钱柳生理特性的影响。结果表明：适当质量浓度的PP333处理能有效促进苗木地茎相对生长量，提高叶片可溶性蛋白、可溶性糖以及药用次生代谢物三萜、山奈酚和槲皮素的质量分数，刺激超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的升高，但对苗高生长起抑制作用。PP333质量浓度为400 mg/L时对地茎相对生长量、可溶性蛋白和槲皮素促进作用最佳，与对照相比，分别增加了180.49%、48.14%和100.00%，均达显著水平。PP333为600 mg/L时对可溶性糖、三萜、山奈酚质量分数以及SOD、POD、PAL活性刺激作用最强，分别比对照增加了32.22%、46.02%、22.88%、46.66%、53.68%和67.51%，差异显著。以上结果说明，适当质量浓度的多效唑处理可调节青钱柳苗木代谢特性，提高苗木抗逆性，刺激药用成分的合成。

青钱柳；多效唑；生理特性；次生代谢物

Cyclocaryapaliurus; Paclobutrazol; Physiological characteristics; Secondary metabolites

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)又名摇钱树、铜钱树，为胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)落叶乔木，是中国特有的单种属植物之一，也是国家重点保护的珍稀濒危植物，具有很高的保护和开发应用价值[1]。经研究表明，青钱柳有降血压、降血糖和降血脂等功效，能增强机体免疫力和抗氧化、抗衰老等功效，这主要与其富含的有机成分有关[2-4]。目前，关于青钱柳的人工林资源培育、理化成分、保健药用功能等先后取得了一些重要的研究进展[4]，但对青钱柳药用次生代谢物含量调控的研究尚少，有关植物生长调节物质对青钱柳苗木生长生理及次生代谢物含量调控的研究，国内外尚未见报道。本文以3年生青钱柳实生苗为试验材料，通过叶面喷施不同质量浓度的多效唑来探讨其对青钱柳生长、生理及叶片中部药用次生代谢物含量的影响，以期为青钱柳药用资源的开发利用提供理论依据。

1 研究区概况

试验地设在江苏省溧阳市凌峰生态农庄，地处亚热带季风气候区，干湿冷暖，四季分明，雨量充沛。年均降水量1 149.7 mm。日照时间为1月份约137.6 h，7月份约229 h。年平均温度17.5 ℃，无霜期长。土壤类型为黄棕壤，有机质、全氮、速效磷、速效钾质量分数分别为30.0、1.5 g/kg，15、150 mg/kg，pH值6.5。

2 材料与方法

供试材料为3年生青钱柳(Cyclocaryapaliurus)实生苗。试验于2012年6—8月进行，多效唑处理共设4个质量浓度，分别为0(对照)、200、400、600 mg/L。试验采用完全随机区组设计，每处理3个重复，选取生长状况较为一致的苗木进行标记。处理采用叶面喷施的方法，对青钱柳苗木全株喷施，以叶面滴水为限，每隔15 d喷施1次，处理2次，30 d后对各处理苗木当年生中上层朝南方向部位的叶片进行取样，用于以下各项指标的测定。

2.1 生长指标的测定

苗高生长量测定采用卷尺测各处理组的15株青钱柳苗高，测量两次，分别为0(H0)、45 d(H1)。苗高相对生长量计算公式为：RH=(H1-H0)/H0。

地茎生长量采用游标卡尺测各处理组的15株青钱柳苗木地茎，测量两次，分别为0(D0)、45 d(D1)。地茎相对生长量计算公式为：RD=(D1-D0)/D0。

2.2 生理指标的测定

可溶性蛋白质量分数采用考马斯亮蓝G-250法测定[5]；可溶性糖质量分数用蒽酮比色法测定[5]；超氧化物歧化酶(SOD)活力用氮蓝四唑(NBT)还原法测定[5]；过氧化物酶(POD)活力用愈创木酚法测定[6]；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力采用苯丙氨酸比色法测定[7]，各指标测定均3个重复。

2.3 药用次生代谢物质量分数的测定

2.3.1 槲皮素和山柰酚质量分数的测定

青钱柳鲜叶经过60 ℃干燥至恒质量，研碎，过筛后称取干粉1.0 g(精度0.001 g)于圆底烧瓶中，精确加入25 mL甲醇—盐酸混合溶液(V(甲醇)∶V(25%盐酸)=4∶1)，闭塞，称质量，沸水浴回流1 h，自然冷却后称质量，以甲醇补足损失的质量，摇匀，过滤，再将滤液过0.45 μm硝酸纤维素膜，作为HPLC测试液。

色谱柱：Eclipse XDB-C18 Column,4.6 mm×150.0 mm，5.0 μm；流动相：V(甲醇)∶V(0.5%磷酸水溶液)=55∶45；流速1 mL/min；检测波长360 nm；进样量为10 μL；柱温30 ℃；进样器为安捷伦自动进样器；外标法计算其质量分数。

对照样品溶液的制备：分别准确称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山柰酚标准样品，加甲醇制成质量浓度梯度为6、12、24、30、60 mg/L的溶液，制作标准曲线。

2.3.2 总三萜的提取与测定

取青钱柳叶干粉0.5 g，加入体积分数为65%乙醇超声提取，然后以3 000 r/min的转速离心10 min，合并各级提取液并在60 ℃条件下真空浓缩挥干乙醇，定容后得预处理液，预处理液经石油醚脱脂(等体积萃取脱脂2次)，然后使用饱和正丁醇萃取(等体积萃取)，然后置于容量瓶内，作为待检测液。

标准曲线的测定参照徐睿庸、洪艳平等[8]方法。检测标准曲线的绘制如下：精确吸取对照品人参皂甙Rb1(62 μg/mL)溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分别加入具塞试管，水浴挥干。分别加入50 g/L香草醛—冰乙酸0.3 mL和高氯酸0.6 mL混匀，水浴80 ℃ 10 min，迅速冷却后加入3 mL冰乙酸，于550 nm波长测定吸光度。样品液测定，吸取样液0.5 mL，加入50 g/L香草醛—冰乙酸0.3 mL和高氯酸各0.6 mL混匀，水浴80 ℃ 10 min，迅速冷却后加入3 mL冰乙酸，于550 nm波长测定吸光度。

2.4 数据处理

采用Excel 2003软件绘图，SPSS 17.0软件进行差异显著性分析(P<0.05)。

3 结果与分析

3.1 多效唑对青钱柳苗木生长指标次生代谢物的影响

由表1可知，叶面喷施多效唑对青钱柳苗木高生长具有抑制作用，随着处理质量浓度的增加，苗高相对生长量逐渐下降，且不同质量浓度处理均显著低于对照(P<0.05)，其中600 mg/L处理抑制作用最强，苗高相对生长量仅为CK的52.08%。

叶面喷施不同质量浓度的多效唑对青钱柳苗木地茎生长均具有明显的促进作用。随着处理质量浓度的增加，促进效应呈先增后降的趋势，其中400 mg/L处理促进效应最佳，比CK增加了180.49%，差异显著(P<0.05)。以上结果说明适当质量浓度的多效唑处理虽然抑制了青钱柳苗木的高生长但显著促进了增粗生长，对壮苗具有明显效果。与CK相比，多效唑处理除了200 mg/L处理叶片三萜质量分数有所下降(但与CK差异不明显)外，400和600 mg/L处理均能促进叶片三萜质量分数的增加，分别提高了33.51%和46.02%，且与CK差异显著(P<0.05)。

多效唑处理对青钱柳叶片山奈酚质量分数的影响与三萜类似，400、600 mg/L处理均显著提高了叶片山奈酚的量，分别比对照增加了19.81%、22.88%，差异显著(P<0.05)。

各质量浓度的多效唑处理均能不同程度地提高叶片槲皮素的量，且与对照差异显著(P<0.05)，促进效应随着处理质量浓度的增加呈现先增后降的趋势，其中400 mg/L处理效果最佳，比CK增加了100.0%。

以上结果说明适当质量浓度的多效唑处理可有效提高青钱柳苗木叶片药用次生代谢物三萜、山奈酚和槲皮素的质量分数，总体以400～600 mg/L质量浓度处理效果较好，对槲皮素质量分数的提高作用最强。

表1 不同质量浓度多效唑对青钱柳苗木生长及次生代谢物质量分数的影响

注：表中数据为平均值±标准误；同列不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

3.2 多效唑对青钱柳生理指标的影响

由表2可知，叶面喷施不同质量浓度的多效唑对青钱柳苗木叶片各生理指标均有不同程度的影响。随着多效唑处理质量浓度的增加，可溶性蛋白质量分数呈先升后降的趋势，均高于CK，其中400 mg/L处理对蛋白质质量分数的提高作用最明显，与CK相比增加了48.14%，差异显著(P<0.05)。可溶性糖质量分数以及PAL、SOD和POD活性总体上随着处理质量浓度的增加而升高，以600 mg/L处理促进效果最佳，与CK相比，分别提高了32.22%、67.51%、46.66%和53.68%，均与CK差异显著(P<0.05)。以上结果说明适当质量浓度的多效唑处理均能显著提高青钱柳叶片可溶性蛋白质和可溶性糖的质量分数，促进PAL、SOD和POD活性的升高，并呈现明显的质量浓度效应。

表2 不同质量浓度多效唑对青钱柳苗木生理指标的影响

注：表中数据为平均值±标准误；同列不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。

4 结论与讨论

多效唑(PP333)是一种人工合成的植物生长延缓剂，在农林业生产中常用于控制营养生长，促进茎增粗，使叶色深绿、变厚，具有壮苗作用，其机制与抑制赤霉素生物合成过程中贝壳杉烯氧化为贝壳杉烯酸的转化有关[9]。本研究表明，适当质量浓度的多效唑叶面喷施处理，能有效促进青钱柳苗木的增粗生长、抑制伸长生长，从而起到壮苗效果，为青钱柳苗木生产中适时壮苗提供依据。

多效唑能改善苗木的生理特性，提高苗木的抗逆性。研究表明，多效唑能显著提高叶片叶绿素、可溶性糖，可溶性蛋白质量分数，提高光合效率，并可有效提高SOD，POD，CAT等保护酶的活性，增强抗逆能力[10-14]。王芳等[15]研究表明，PP333处理后POD活性提高并保持较高活性，可以促进蛋白质的合成和延缓蛋白质的降解。本研究结果也表明，适当质量浓度的多效唑处理可显著提高青钱柳叶片可溶性蛋白和可溶性糖的质量分数，增强SOD，POD，CAT等保护酶的活性，总体以600 mg/L质量浓度处理效果最佳，可溶性糖的质量分数的增加有利于提高叶片的渗透调节能力，而SOD、POD活性的增高有利于增强植物体对超氧阴离子自由基和过氧化氢的降解能力，维持活性氧代谢的平衡，因而能增强青钱柳苗木的抗逆能力。

槲皮素、山奈酚、异槲皮苷为青钱柳叶片主要药用次生代谢物，具有抗氧化功效，摄入量与癌症及心脑血管等疾病的发生有着密切的关系[16-19]。其含量高低是衡量青钱柳叶片品质的重要指标[20]。因此，对其含量调控的研究具有重要的理论和应用意义。本研究表明，适当质量浓度的多效唑处理可有效促进青钱柳叶片槲皮素、山奈酚、三萜质量分数的提高，同时也显著促进了叶片PAL酶的活性。PAL为植物次生代谢过程中的关键酶和限速酶，其催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式肉桂酸[21-22]，进入苯丙烷类代谢途径，产生香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，进一步转化为香豆素、绿原酸，也可以形成CoA酯，再进一步转化为类黄酮、木质素、生物碱等[23-24]。因而，PAL活性的升高，可能有利于初生代谢向次生代谢的转化，合成较多的山奈酚、异槲皮苷等黄酮类等次生代谢物。刘金福等[25]的研究也表明生长调节剂乙烯利喷施处理，可刺激苦荞次级代谢产物黄酮的生成和提高苯丙氨酸氨解酶(PAL)活性，PAL活性与黄酮的量变化基本上是相符的，PAL活性升高，黄酮合成量也增加。但有关多效唑刺刺激槲皮素、山奈酚、三萜合成的具体机制尚待进一步研究。

本研究初步表明，适当质量浓度的多效唑叶面喷施处理可有效调节青钱柳苗木生理功能，提高苗木的抗逆性，同时促进槲皮素等主要次生代谢物含量的提高。但有关多效唑最适处理的时间、质量浓度以及有关调节机制等尚需进一步探讨和验证。目前，有关植物生长调节剂对青钱柳苗木生长、生理调节作用的研究尚少，多效唑对青钱柳苗木生理特性及药用次生代谢物含量调节作用的研究尚未见报道。多效唑作为农业生产中常用的生长调节剂，具有成本低、高效低毒，应用技术成熟、适合推广等优点[26]，本研究结果为青钱柳苗木生产及药用资源开发利用提供应用参考。

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1) 国家级大学生创新创业训练计划项目(201210298004)；江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目(201210298004)；江苏高校优势学科建设工程资助项目。

郭楠，女，1992年12月生，南京林业大学森林资源与环境学院，在读本科生。

谢寅峰，南京林业大学森林资源与环境学院，教授。E-mail:xxyyff@njfu.com.cn。

2013年7月22日。

S718.43

Effects of Paclobutrazol (PP333) on the Physiological Characteristics inCyclocaryapaliurusSeedlings/Guo Nan, Zhang Yingying, Liu Nana, Xie Yinfeng, Fang Shengzuo(Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(4).-42～45

责任编辑：潘 华。

The effects of paclobutrazol (PP333) on the physiological characteristics inCyclocaryapaliurusleaves of 3-year-old seedlings were investigated by spraying different contents of PP333. The stems relative growth yield, content of soluble protein, soluble sugar as well as the drug secondary metabolites including triterpenoid, kaempferol and quercetin in leaves ofCyclocaryapaliurusare effectively improved by adding a suitable concentration of PP333, the activity of superoxide dismutase (SOD), peroxidase(POD) and phenylalanine ammonia-lyase(PAL) increase at the high levels, while the seeding relative growth yield are delayed. 400 mg/L treatment is the best to promote the stems relative growth yield, content of soluble protein and quercetin. Compared with those of the control, the above indexes increase by 180.49%, 48.14% and 100.0%, respectively. 600 mg/L treatment can improve the content of soluble sugar, triterpenoid and kaempferol as well as the activity of SOD, POD and PAL with a maximum stimulation. Compared with those of the control, the above indexes increase by 32.22%, 46.02%, 22.88%, 46.66%, 53.68% and 67.51%. The suitable content of PP333can regulate the metabolic characteristic ofCyclocaryapaliurus, increase seedling resistance and stimulate the medicinal components synthesis.