内源性大麻素系统在慢性间歇低氧大鼠心肌肥厚病理过程中的作用*

张晋源，陈彦，肖玲，唐茜，王蓓，范艳锋

研究证实阻塞型睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）患者易合并高血压、扩张型心肌病等疾患[1]，中、重度OSAHS患者普遍存在左心室肥厚[2]。研究发现扩张性心肌病在药物基础上使用无创呼吸机后，心脏结构发生可逆性改变[3]。该病表现为心肌肥厚[4]，目前多采用钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）与心肌营养素-1(CT-1)作为心肌肥厚损伤评价指标，两者持续过度激活与心脏重构密切相关[5]。内源性大麻素系统中受体1过度表达是导致心血管疾病的原因之一[6]。利莫那班阻断大麻素受体1, 改善肥胖、糖代谢紊乱等，从而可降低心血管事件危险因素。那么，OSAHS患者存在的心肌肥厚是否与内源性大麻素系统紊乱相关呢？本研究旨在通过慢性间歇低氧模型探讨内源性大麻素系统在心肌肥厚病理过程中的作用，并观察使用利莫那班后对其的影响。

1 材料与方法

材料：①动物：2012-11至2013-07选取普通级雄性Wistar大鼠48只，体重200～250 g，购自山西医科大学动物实验中心。48只大鼠随机分为正常对照即根据充气时间又分为正常对照4周组，正常对照6周组；间歇低氧大鼠即根据低氧时间又分为低氧4周组，低氧6周组；间歇低氧+利莫那班干预即根据低氧时间又分为间歇低氧4周+利莫那班组（简称低氧拮抗4周组），低氧拮抗6周组。共6组，每组均为8只。②主要试剂：兔抗钙/钙调素依赖性蛋白激酶II-CaMKIIα/δ（M281）抗体购于Bioworld（Minnesota，USA）公司，CT-1抗体、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，利莫那班（SR141716）购于Selleckchem（Texas，USA ）。

慢性间歇低氧模型的制备：每天分别循环充入不同流速的压缩空气（5 L/min及10 L/min）和纯氮，每一循环为120 s，先充入纯氮使低氧舱中氧含量在30 s内从21%分别下降至各组最低值（8%～9%），再充入50 s以上不同流速压缩空气使舱内氧含量尽快恢复至接近 21%，最后充入 40 s 5 L/min 压缩空气使舱内氧含量以21%维持至下个循环。大鼠每天暴露8 h（9：00 am～5：00 pm）。干预的各组每天造模前腹腔内注射利莫那班每只大鼠1 mg/kg，0.5 h后开始通气。

大鼠标本处理:分别于间歇低氧4周及6周后随机抽取各组一半数目大鼠，给予以下处理：10%的水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射后，剪开胸廓，立即取出心脏，用预冷的生理盐水漂洗，沿房室交界处剪去血管根部，左、右心房及心耳， 沿室间隔分离出左心室（含室间隔），用滤纸吸干，称左心室重量，并计算左心室重量与体重之比，作为左心室肥厚指标，即左心室质量指数（LVMI）[7]。再注入4%多聚甲醛300～350 ml固定液，在4%多聚甲醛中4℃固定24 h，石蜡包埋，切片。苏木素伊红（HE）染色，光镜下观察心肌变化：常规脱蜡至水后，HE染色10 min、水洗 ，然后 1% 盐酸酒精分化 1～2 s 、水洗，再经过1%氨水返蓝液1～2 min、水洗， 0.5%水溶性伊红 10 s～1 min、水洗，接着乙醇脱水、二甲苯透明后，中性树胶封片。光学显微镜下观察心肌细胞形态变化。

免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法：检测CaMKII α/δ、CT-1在心脏表达水平，参照文献[8]。

统计学方法：计量资料用x±s表示，采用SPSS 16.0软件进行分析，两样本均数比较采用完全随机设计两样本t检验，相关性检验采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组化半定量分析显示间歇低氧和利莫那班干预对大鼠心肌左心室质量指数比较。（表1）

表1 免疫组化半定量分析显示间歇低氧和利莫那班干预对大鼠心肌CaMKⅡ、CT-1水平的影响（n=8,±s）

由表1可见，低氧4周组、低氧6周组表达分别强于正常对照组4周组（t=108.674，P＜0.001）、正常对照6周组（t=387.553，P＜0.001）；低氧6周组表达强于低氧4周组（t'=6.278，P＜0.001）；低氧4周组、低氧6周组表达分别强于低氧拮抗4周组（t'=59.818，P＜0.001）、低氧拮抗6周组（t=96.462，P＜0.001）；低氧拮抗6周组表达强于低氧拮抗4周组（t=205.897，P＜0.001），组间比较差异均有统计学意义。

病理组织学所见：心肌组织病理学改变：光镜下① 正常对照4周组：心肌细胞排列整齐，未见肥大，间质中无炎细胞浸润；②低氧4周组：心肌细胞轻度肥大，胞浆丰富，胞核增大；③低氧拮抗4周组：心肌细胞间距稍有增大，少许炎细胞浸润；④ 正常对照6周组：未见心肌细胞肥大；⑤低氧6周组：细胞间距增大，胞浆丰富、着色深，胞核增大呈浓染，心肌纤维增粗、排列紊乱，血管周围少量炎细胞浸润，间隙有红细胞渗出；⑥低氧拮抗6周组：间隙增宽，胞浆凝聚，少量炎细胞浸润，红细胞渗出。（图1）

图1 心肌组织病理学改变(HE ×400)

CaMKⅡ、CT-1在心肌组织的免疫组化表达（图2、3，以下数值t1、P1为CaMKⅡ的数值，t2、P2为CT-1的数值）：正常对照4周组、正常对照6周组大鼠心肌组织中有少量CaMKⅡ、CT-1表达（低表达），CaMKⅡ分布于胞浆及胞核，CT-1分布于胞浆；低氧4周组和低氧拮抗4周组（弱阳性表达），低氧6周组和低氧拮抗6周组CaMKⅡ、CT-1表达明显增强（强阳性表达），阳性着色明显升高[免疫组化图片 CaMK Ⅱ见图 2（A～G）、 CT-1 见图 3（A～F）]，CaMKⅡ分布于胞浆及胞核，CT-1分布于胞浆，其中低氧4周组表达强于正常对照4周组（t1'=4.952，P1＜0.001、t2=4.963，P2＜0.001）、低氧 6 周组表达强于正常对照6周组（t1=11.765，P1＜0.001、t2'=13.943，P2＜0.001）、低氧6周组表达强于低氧4周组（t'1=2.902，P1＜0.005、t2'=6.278，P2＜0.001）、 低 氧 4 周 组 表 达强于低氧拮抗4周组（t'1=2.653，P1=0.01、t2=2.422，P2＜0.05）、低氧6周组表达强于低氧拮抗6周组（t1=6.970，P1＜ 0.001、t2=4.250，P2＜0.001），低氧拮抗6周组表达强于低氧拮抗4周组（t'1=2.54，P1＜0.014、t2'=5.555，P2＜0.001），组间比较差异均有统计学意义。各组大鼠平均光密度值详见表1。CT-1与CaMKⅡ呈正相关关系，相关系数r=0.426，P＜0.01。

图2 CaMKⅡ在心肌组织免疫组化表达 （DAB ×400）。余注见表1

图3 CT-1在心肌组织免疫组化表达 （DAB ×400）。余注见表1

3 讨论

夜间反复发生的慢性间歇低氧是OSAHS最主要病理生理改变，其可参与氧化应激、炎症反应、心脏自主神经功能紊乱等多种过程，被认为是心血管事件的独立危险因素。

越来越多的证据显示对于心血管疾病而言OSAHS是一个重要的可干预的危险因素，但具体机制尚未清楚。左心室重量指数、CaMKⅡ、CT-1是心肌肥厚损伤常用的评价指标，三者与心律失常、心室重塑等密切相关，国外研究已证实在实验性心肌病状态下CaMKⅡ、CT-1出现过度表达[9]，因此检测三者的表达可明确反映心肌肥厚的变化。而在本研究同样发现慢性间歇低氧模型低氧组大鼠心肌组织中左心室质量指数值以及CaMKⅡ、CT-1表达明显增加，并随着低氧周数的延长表达增加更明显。

既然慢性间歇低氧中确实发生了心肌肥厚，那么其机制是什么呢？目前关于OSAHS导致心肌肥厚可能与以下几个方面相关：①自主神经功能紊乱；②氧化应激及炎症反应；③血管内皮损害；④血流粘度增高、高凝状态、纤溶系统异常；⑤内分泌代谢异常；⑥胸腔内压的改变，但其具体机制仍在进一步探讨。

本课题组前期临床实验已发现OSAHS患者存在内源性大麻素系统紊乱，内源性大麻素紊乱可导致糖代谢紊乱、氧化应激、炎症因子活化、神经系统紊乱以及体温调节障碍等多系统的病理过程，并且被认为是心血管事件的危险因素。那么内源性大麻素系统紊乱与心肌肥厚是否存在关联呢？

大麻素受体1是内源性大麻素系统的主要受体，由于内源性大麻素系统调节体内多种生理功能均通过大麻素受体1完成[10]，因此目前研究多通过检测大麻素受体1来评价内源性大麻素系统变化。由于大麻素受体1主要表达于肝脏、胃肠道、胰腺和脂肪细胞，但其在心肌中表达较少。因此直接测定其在心肌中表达并不容易，本研究采用内源性大麻素受体拮抗剂利莫那班预先干预，旨在从另一层面证实心肌肥厚中该系统所发挥的作用，结果发现使用利莫那班组大鼠心肌组织中CaMKⅡ 、CT-1表达较单纯低氧组明显减少，提示利莫那班对慢性间歇低氧所造成的心肌细胞损害有一定保护作用，从而证实OSAHS导致的慢性间歇低氧可发生内源性大麻素系统紊乱，最终导致心肌肥厚发生。分析其原因可能为：①内源性大麻素系统活性升高不仅具有增加食欲促进摄食等中枢性作用，同时还影响周围组织能量代谢，引起体重增加，引发血脂异常；②内源性和外源性大麻系统可能表现出对心血管系统直接影响，心肌、血管及神经末梢大麻素受体激活后能够观察到明显生理效应；③内源性大麻素系统过度激活促进动脉粥样硬化的炎症；④内源性大麻素系统导致胰岛素抵抗。内源性大麻素系统过度活跃导致以上心血管代谢危险发生，进而引起心肌肥厚。而利莫那班选择性阻断大麻素受体1，可以显著降低体重，并且在出现超重或肥胖、促进动脉粥样硬化发展的血脂紊乱、高血压及2型糖尿病的高危人群中可以改善若干代谢危险因素。通过利莫那班阻断大麻素受体1，从而降低心血管事件危险因素。

综上所述，OSAHS患者出现心肌肥厚病理改变的可能机制之一为内源性大麻素系统的紊乱，而提早使用利莫那班干预可减少心肌肥厚病理过程，对慢性间歇低氧导致的心肌损害具有一定保护作用，这为进一步减轻慢性间歇低氧造成的心肌损害提供了一定的临床思路。

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