春石斛继代培养主要影响因素1)

李秋玲 李 青 刘 燕 叶香娟

(北京林业大学,北京,100083)

春石斛继代培养主要影响因素1)

李秋玲 李 青 刘 燕 叶香娟

(北京林业大学,北京,100083)

以春石斛品种‘火鸟’(Dendrobiumnobile‘Huoniao’)茎段诱导出的侧芽为试验材料，研究了基本培养基、植物生长调节剂、不同氮素的比例与水平、有机添加物对春石斛丛生芽增殖的影响。结合生长情况，选出最适宜的增殖培养基。结果表明，丛生芽增殖培养适宜的基本培养基为1/2MS；添加0.10 mg·L-1的TDZ和0.10 mg·L-1的NAA可得到较高的增殖系数；以1/2MS基本培养基中的氮素为对照，改变氮素的比例与水平，均对春石斛的增殖有一定的抑制作用；有机添加物以添加100 g·L-1的马铃薯泥促进效果较好。

春石斛；继代培养；丛生芽；增殖系数；组织培养

We used mixed buds by inducing stem section ofDendrobiumnobile‘Huoniao’ as the materials to study the effects of basic media, plant growth regulators, different levels of N and different organic additives on the plantlets multiplication. Combined with the status of growth, we chose the best multiplication media. The best basic media for multiplication is 1/2MS. Adding 0.10 mg·L-1TDZ and 0.10 mg·L-1NAA, we can obtain a higher proliferation rate. Compared to N of 1/2MS basic media, changing the proportion and levels of N has certain inhibitory effects on the plantlets multiplication. Adding mashed potato 100 g·L-1has a better effect on promoting multiplication.

KeywordsDendrobiumnobile; Subculture; Cluster buds; Multiplication ratio; Tissue culture

春石斛(Dendrobiumnobile)是石斛属植物中早春开花的一类，因此得名。春石斛的园艺栽培品种具有较高的观赏价值，花色艳丽、观赏期长，花期又与我国的传统节日春节基本相吻。因此，春石斛逐渐成为年宵花卉的新宠，呈现供不应求的态势[1-2]。我国的春石斛品种基本上从日本进口，使我国春石斛的发展受到极大的限制[3]，而且常规繁殖方法远不能满足商品化生产的需求。组织培养作为一种快速繁殖技术以其独特的优势来解决这一供求现状。近年来有关春石斛组织培养的研究也有不少报道，研究方向主要集中在离体培养的快速繁殖上和对各培养阶段的优化上[4-7]，春石斛的离体多倍体诱导[8]和试管开花[9]也有少量报道。根据现在市场对春石斛的需求量，如何提高春石斛组织培养过程中的增殖系数显得尤为重要[10]。本试验对春石斛丛生芽途径的增殖阶段进行了关键影响因素的研究，以期找到更加有效的增殖配方。

1 材料与方法

春石斛盆栽苗(图1)来自浙江森禾种业股份有限公司。

图1 盆栽苗

以春石斛优良品种‘火鸟’的1年生带节茎段(图2)为外植体，诱导侧芽萌发，以1.50 cm左右的侧芽(图3)为试验材料进行增殖培养。

基本培养基对春石斛丛生芽增殖的影响：分别以1/2MS、MS、B5、Miller为基本培养基，添加1.00 mg·L-1的6-BA和0.50 mg·L-1的NAA[11]，接种45 d后统计增殖系数、株高以及继代苗的生长情况。

不同质量浓度TDZ、NAA对春石斛丛生芽增殖的影响：激素质量浓度是影响植物生长的关键因素。根据前期试验，选择TDZ、NAA两种激素，各设置4个质量浓度水平。采用完全随机区组试验，以1/2MS为基本培养基，研究TDZ、NAA的不同质量浓度及配比对丛生芽增殖和生长情况的影响。接种45 d后统计增殖系数、株高以及继代苗的生长情况。

图2 带腋芽茎段

图3 侧芽诱导成功

TDZ的4个质量浓度水平：0.05、0.10、0.20、0.50 mg·L-1。

NAA的4个质量浓度水平：0.05、0.10、0.20、0.50 mg·L-1。

有机添加物对春石斛丛生芽增殖的影响：以1/2MS为基本培养基，添加TDZ0.10 mg·L-1和NAA0.10 mg·L-1，在此基础上分别添加苹果泥50、100 g·L-1，香蕉泥50、100 g·L-1，马铃薯泥50、100 g·L-1，水解乳蛋白1、2 g·L-1，以不添加有机物的培养基作为对照，接种45 d后统计增殖系数、株高以及继代苗的生长情况。

培养条件：接种后置于培养室中培养，培养温度(23±2)℃，光照强度2 000 lx，光照时间14 h·d-1。培养基中其他成分：3.0%蔗糖、0.6%琼脂。pH值为5.4。

数据统计：增殖系数=增殖后芽的个数/接种芽的个数；每个处理30株，重复3次。文中表格使用Microsoft Excel软件绘制。使用SPSS18.0分析软件对数据进行处理，运用最小显著差数法(LSD法)比较分析数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 基本培养基对春石斛丛生芽增殖的影响

分别以1/2MS、MS、B5、Miller为基本培养基，添加1.00 mg·L-1的6-BA和0.50 mg·L-1的NAA，侧芽接种45 d后统计‘火鸟’增殖系数、株高以及生长情况(表1)。

表1 基本培养基对‘火鸟’增殖的影响

注：“+++”表示继代苗生长较好，“++++”表示继代苗生长健壮；表中平均增殖系数与平均株高为平均值±标准差，同列不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著。

对统计结果进行方差分析与多重比较，结果表明，不同的基本培养基对增殖系数和株高的影响均达到了显著的差异。增值系数方面，以1/2MS基本培养基的增殖效果最好，达到了2.86，B5培养基的增殖效果最差，仅有2.32，与1/2MS培养基增殖系数相差了0.54。这些差异是由于不同的基本培养基含有的营养成分及浓度有所不同，对植物生长的作用不同。1/2MS、MS与Miller、B5增殖系数之间达到了显著差异。1/2MS、MS培养基的生长情况也优于Miller、B5培养基。而1/2MS与MS培养基之间、Miller与B5培养基之间均无显著差异，这说明MS基本培养基的营养成分更适合‘火鸟’的增殖与生长，1/2MS、MS培养基的成分及浓度均能够满足‘火鸟’增殖与生长的需求。1/2MS与MS增殖系数之间虽无显著差异，但统计结果显示，1/2MS培养基的增殖效果略优于MS基本培养基。从成本方面考虑，1/2MS比MS培养基浓度低，更加节约成本。1/2MS、MS、Miller对‘火鸟’株高的影响要优于B5，且达到了显著差异，而前3种基本培养基对株高的影响并无显著差异。综合考虑，应选择1/2MS作为‘火鸟’丛生芽途径增殖的基本培养基(图4、图5)。

图4 丛生芽诱导与增殖成功

图5 试验整体情况

2.2 不同质量浓度TDZ、NAA对春石斛丛生芽增殖的影响

将生长一致的芽体接种到含有不同质量浓度生长调节剂的丛生芽增殖培养基中，培养45 d后统计‘火鸟’在不同增殖培养基中的增殖系数、株高以及生长情况(表2)。

表2 不同TDZ、NAA质量浓度对春石斛增殖的影响

注：“++”表示继代苗生长一般；“+++”表示继代苗生长较好；“++++”表示继代苗生长健壮；表中平均增殖系数与平均株高为平均值±标准差。

对表2进行方差分析，结果表明，区组间无显著差异，说明组织培养的培养环境具有较高的一致性，是工厂化生产得到生长一致的组培苗的前提条件。经不同质量浓度TDZ处理的‘火鸟’增殖系数、株高之间分别达到显著差异；而经不同质量浓度NAA处理的‘火鸟’增殖系数之间存在显著差异，但株高之间差异不显著。针对不同质量浓度TDZ、NAA对春石斛增殖的影响作单因子多重比较(表3)。

表3 不同质量浓度TDZ、NAA对春石斛增殖影响的单因子多重比较

激素质量浓度/mg·L-1平均增殖系数平均株高/cmTDZ0.05(2.31±0.04)c(1.18±0.02)c0.10(2.62±0.05)a(1.57±0.02)a0.20(2.44±0.03)b(1.34±0.05)b0.50(2.26±0.03)c(1.15±0.03)cNAA0.05(2.25±0.02)b(1.32±0.05)a0.10(2.57±0.02)a(1.31±0.02)a0.20(2.59±0.04)a(1.33±0.01)a0.50(2.22±0.01)b(1.29±0.05)a

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著。

多重比较结果表明，随着TDZ质量浓度的升高，增殖系数与株高均呈现先升高后降低的趋势，说明过低或过高的TDZ质量浓度均不利于丛生芽的增殖。当TDZ的质量浓度为0.10 mg·L-1时，‘火鸟’的增殖系数最大达到了2.62，株高最高为1.57 cm。与其他质量浓度水平的增殖系数与株高达到了显著差异，所以添加0.10 mg·L-1的TDZ比较适合‘火鸟’的增殖培养。

随着NAA质量浓度的升高，增殖系数呈现先升高后降低的趋势，说明适宜的NAA质量浓度是提高丛生芽增殖率的关键因素之一。当NAA的质量浓度为0.20 mg·L-1时，‘火鸟’的增殖系数最高，但与0.10 mg·L-1水平的平均增殖系数非常接近，并无显著差异，而NAA的这两水平与其他水平间都达到了显著差异，所以添加0.10～0.20 mg·L-1的NAA比较适合‘火鸟’的增殖培养，但从节约成本方面考虑，在有相同诱导效果的前提下，应选择添加低质量浓度的外源激素。降低成本的同时也减少了外源激素在植物体内的积累，减缓了激素积累对植物生长的不利影响，从而增加有效的继代次数，也间接降低了生产成本。

综合以上分析，添加0.10 mg·L-1的TDZ、0.10 mg·L-1的NAA适宜‘火鸟’丛生芽增殖培养。

2.3 不同氮素水平对春石斛丛生芽增殖的影响

表4 不同N素水平对春石斛增殖的影响

注：“++”表示继代苗生长一般，“+++”表示继代苗生长较好，“++++”表示继代苗生长健壮；表中平均增殖系数与平均株高为平均值±标准差;同列不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著。

2.4 有机添加物对春石斛丛生芽增殖的影响

以1/2MS为基本培养基，添加TDZ0.10 mg·L-1和NAA0.10 mg·L-1，在此基础上分别添加不同质量浓度的各种有机添加物，以不添加有机物的培养基作为对照，接入45 d后统计‘火鸟’增殖系数、株高以及生长情况(表5)。

表5 有机添加物对春石斛增殖的影响

注：“+”表示继代苗生长较差，“++”表示继代苗生长一般，“+++”表示继代苗生长较好，“++++”表示继代苗生长健壮；表中平均增殖系数与平均株高为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著。

从表5可看出，添加不同的有机添加物对‘火鸟’的增殖有不同的影响，添加香蕉泥、马铃薯泥、水解乳蛋白均对‘火鸟’的增殖有促进作用，但添加苹果泥降低了‘火鸟’的增殖系数，而且随着苹果泥质量浓度的增加，抑制作用越明显，生长情况也弱于对照。这可能是由于添加苹果泥会降低培养基的pH值，不利于植物的增殖和生长。

对统计结果进行方差分析和多重比较，添加1 g·L-1水解乳蛋白、100 g·L-1的香蕉泥、100 g·L-1的马铃薯泥对‘火鸟’增殖系数的影响无显著差异，但均与对照达到了显著的差异，具有良好的促进效果。添加100 g·L-1的香蕉泥或100 g·L-1的马铃薯泥均比分别添加50 g·L-1的促进效果好，都没有达到显著差异，但添加50 g·L-1香蕉泥或马铃薯泥时，增殖系数均与对照无显著差异，因此，应添加100 g·L-1的香蕉泥或100 g·L-1的马铃薯泥。添加1 g·L-1的水解乳蛋白比添加2 g·L-1时的促进效果好，两者无显著差异，但都与对照有显著差异，这说明超过一定的质量浓度，水解乳蛋白的促进作用有所降低。添加水解乳蛋白虽然对增殖有较好的促进效果，但小苗生长势弱，不宜作为‘火鸟’的有机添加物。100 g·L-1的香蕉泥与100 g·L-1的马铃薯泥对增殖的促进效果相似，但考虑到价格问题，为集约化生产节约成本，马铃薯泥为‘火鸟’增殖适宜的有机添加物，质量浓度为100 g·L-1。

3 结论与讨论

适宜的基本培养基为1/2MS基本培养基；适宜‘火鸟’增殖的TDZ和NAA的质量浓度配比为0.10 mg·L-1和0.10 mg·L-1；从促进效果及成本方面考虑，添加100 g·L-1的马铃薯泥为宜。所以‘火鸟’适宜的增殖培养基为1/2MS+TDZ0.10 mg·L-1+NAA0.10 mg·L-1+马铃薯泥100 g·L-1。

继代培养阶段是组织培养的关键，找到适宜的增殖培养基配方，才能达到组培快速繁殖的目的。随着近年来春石斛的销量增加，有关春石斛组织培养方面的研究也有所增加，有关其丛生芽增殖阶段的研究也有不少报道，但研究结果各有差异。

基本培养基的种类繁多，其中的营养成分及其浓度有所不同，对植物的生长也有较大的影响，MS基本培养基是应用最广泛的基本培养基之一，前人的研究大多选用MS作为基本培养基[12-14]。本试验选用1/2MS、MS、B5、Miller四种营养成分及浓度差异较大的基本培养基，以期找到更适合春石斛增殖的基本培养基，结果表明，1/2MS、MS两种基本培养基都比较适宜春石斛的增殖，并且两者之间无显著差异，说明营养成分对春石斛增殖的影响比浓度的影响大。基于成本考虑，1/2MS更适合作为春石斛丛生芽增殖的基本培养基。

激素对春石斛的增殖及生长起关键的作用。激素的组合及配比不同，增殖系数也有很大的差异。前人研究大多选用BA、NAA组合[12，15-16]，但据前期试验结果发现，TDZ比BA更加有效，因此，本试验选用TDZ、NAA组合，各设4个质量浓度水平做完全区组试验，发现这两个因素均对增殖系数有显著的影响，并得出适宜质量浓度配比为TDZ0.10 mg·L-1、NAA0.10 mg·L-1。

氮元素在植物的生长发育过程中有很重要的作用，被称为生命元素。有关氮素对春石斛增殖的影响的研究较少，但有人研究发现，适宜的比例和水平对增殖有明显的促进作用[17]。本研究结果发现，以1/2MS基本培养基中的氮素为对照，改变氮素的比例与水平，均对春石斛的增殖有一定的抑制作用。但在基本培养基的筛选试验中，1/2MS、MS对春石斛增殖的影响差异并不显著，这可能与各营养成分间的综合作用有关。

本试验研究发现，除苹果泥以外的其他3种有机添加物均能有效地促进春石斛的增殖，尤其是添加1 g·L-1的水解乳蛋白可以得到最高的增殖系数，但由于它对试管苗的生长势有明显的不良影响，所以不得不放弃，具体的作用机理尚不明确，这一结果与时晶晶的研究结果相同[18]。添加100 g·L-1的香蕉泥和100 g·L-1的马铃薯泥，增殖系数无显著差异，考虑成本之后，添加100 g·L-1的马铃薯泥较为适宜。与对照相比，所有添加有机添加物的培养基褐化现象更加严重。这可能是由于有机添加物的复杂成分里有易引起褐化的物质。试验中为克服褐化问题，在褐化显现之初，将芽体转移到干净的位置，可有效控制褐化现象，但此做法增加了不少工作量，不适用于工厂化生产，需要寻求新的解决办法。

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Main Influence Factors ofDendrobiumnobileSubculture/

Li Qiuling, Li Qing, Liu Yan, Ye Xiangjuan(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China)//

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-69～73

李秋玲，女，1988年10月生，北京林业大学园林学院，硕士研究生。

李青，北京林业大学园林学院，副教授。E-mail：wliqing06@sina.com。

2013年6月28日。

S682.31； Q945.52

1) 国家“十二五”科技支撑计划课题(2011BAD12B02-01)。

责任编辑:任 俐。