正交实验优化多频超声波辅助法提取绿茶茶多酚工艺

杨雅瑜，刘玉德，张 媛，石学智

（北京工商大学，材料与机械工程学院，北京 100048）

茶多酚（Tea Polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以黄烷醇类物质（儿茶素）最为重要，含量约占茶多酚总量的70%左右。茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一［1－3］。研究表明，茶多酚等活性物质具有解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外，被健康及医学界誉为“辐射克星”［4－6］。我国对茶多酚的研究始于上世纪五六十年代，到七十年代初已开始专项研究，目前已处于世界领先水平［7－9］。现今茶多酚的功能引起了各国的广泛重视，成为各工业化国家的技术竞争目标和研究开发热点［10－11］。然而，目前应用较多的还是有机溶剂萃取法和金属离子沉淀法，所得产品具有潜在的毒害。并且，大多数茶多酚提取工艺的提取率较低。因此，需大力开发和推广无毒、无污染、高效的茶多酚提取新工艺，并对提取工艺做出进一步改进和创新，提高茶多酚提取率。而超声辅助提取技术作为一种新的提取分离技术对提高茶多酚提取率，降低物耗、能耗等均有显著的作用和优势，有着广阔的应用前景［12－14］。通过目前的研究成果可知，由于超声波具有的机械粉碎和空化效应等作用，增大了物质分子运动频率和速度，从而使多频超声辅助提取茶多酚工艺可以有效提高提取率。本文将多频超声辅助法和传统浸提法两种提取方法进行比较研究，用正交实验优化多频超声辅助法提取茶多酚的工艺，得到最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

陈年绿茶 市售;去离子水 北京工商大学自制;硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等 均为分析纯。

循环超声提取设备 DFXHTQ－900，南京新辰生物科技有限公司;高速万能粉碎机 FW－100，北京中兴伟业仪器有限公司;电子天平 FA2004，上海越平科学仪器有限公司;循环水式真空泵:SHZ－D（Ⅲ） 河南省予华仪器有限公司;紫外可见分光光度计 UVmini－1240，北京东方安诺生化科技有限公司。

1.2 试剂及茶多酚含量测定方法

1.2.1 酒石酸亚铁溶液 称取1.0g硫酸亚铁（FeSO4·7H20）和 5.0g酒石酸钾钠（C14H4O6KNa·4H2O），用水溶解并定容至1L（低温保存有效期10d）。

1.2.2 pH7.5磷酸盐缓冲 0.67mol/L磷酸二氢钾:称取经110℃烘干2h的磷酸二氢钾（KH2PO4）9.08g，加水溶解后定容至1L。

取上述0.67mol/L的磷酸氢二钠溶液85mL和0.67mol/L的磷酸二氢钾溶液15mL混合均匀。

1.2.3 取样 按GB/T8302的规定［15］。

1.2.4 试样制备 按 GB/T8303的规定［16］。样品预处理，将茶叶用万能粉碎机粉碎后过筛（60目），存放于干燥避光备用。

1.2.5 试液制备 传统浸取法将样品茶叶末至于容器中，加入去离子水中，混匀，以提取温度、提取时间与料液比为设定条件进行传统浸提;多频超声辅助法将样品放入循环超声提取设备，以提取温度、提取时间、料液比、超声功率与循环速度为设定条件，进行多频超声波提取。将浸提液和提取液冷却至室温，取上清液置于100mL烧杯中。

随着全球经济的一体化，在高科技发展迅猛的今天，我国各个行业已经进入了信息网络化、自动化的时代，各个行业各个领域都已经离不开信息技术，并在其中发挥了非常重要及关键的作用。通过现代化的信息技术可以更好的归类管理与储存档案信息，可以有效的避免了传统档案管理所存在的缺陷与不足。所以我们政府档案管理人员也应该积极的运用现代信息技术，把人才的优势充分发挥出来，建设一个能够满足本地发展的档案管理体系，这样不仅使档案的安全性得到提高，同时还能够使资料整合性得到有效提高。

1.2.6 茶多酚提取率的测定方法 按照GB/T8313－2002《茶 茶多酚测定》中的方法快速测定提取率［17］。

结果计算方法和公式:

茶多酚提取率，以干态质量百分率表示，按下式计算:

式中:L1－试样的总量，mL;L2－测定时的用液量，mL;M0－试样的质量，g;m－试样干物质含量百分率，%;A－试样的吸光度;1.957－用10mm比色杯。

当吸光度等于0.50时，每毫升茶汤中含茶多酚当1.957mg。如果符合重复性的要求（即同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.5g），则取两次测定的算术平均值作为结果。

1.3 实验方法

1.3.1 料液比对茶多酚提取率的影响 传统浸提法:配制不同料液比的试液，在60℃水温下，浸提30min;多频超声波提取法:设定四种不同频率的超声波同时工作（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W），配制不同料液比的试液，设置温度为60℃，循环速度为700r/min，提取30min。计算两种方法不同料液比的提取率。

1.3.2 提取时间对茶多酚提取率的影响 传统浸提法:配制料液比为1∶80g/mL的试液;多频超声波提取法:设定四种不同频率的超声波同时工作（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W），配制料液比为1∶70g/mL的试液，设置循环速度700r/min，水温60℃。用两种方法分别提取10、20、30、40、50、60、70、80min，并计算相应的提取率。

1.3.3 温度对茶多酚提取率的影响 传统浸提法:配制料液比1∶80g/mL，设定时间为70min;多频超声提取法:设置四种超声波（28kHz，200W、33kHz，200W、40kHz，200W、60kHz，200W）同时工作，配制料液比1∶70g/mL，设定时间为20min。用两种方法分别在 40、50、60、70、80、90℃水温下提取，并计算相应提取率。

1.3.5 循环速度对茶多酚提取率的影响 设置四种超声波（28kHz，200W）、（33kHz，200W）、（40kHz，200W）、（60kHz，200W）同时工作，配制料液比1∶70g/mL，设定时间为20min，温度为60℃，循环速度分别为 300、700、1000、1200、1500、2000r/min，并计算相应的提取率。

1.3.6 多频超声辅助提取茶多酚优化工艺研究［18－20］以单因素实验得到的影响因素作为参考，再用正交实验多频超声辅助提取茶多酚优化工艺进行研究。选择提取时间、提取温度、料液比、超声波功率、超声波频率水平因素，如表1所示，根据混合正交表L16（45）进行正交实验并分析。

1.3.7 实验方法分析 实验方法有单因素实验和正交实验。采用单因素实验方案，分别研究浸提时间、浸提温度、料液比、循环速度与超声功率等因素对茶多酚提取分离效果的影响，找出每个因素的具体影响规律，并确定影响茶多酚浸提率的重要因素的最优水平变化范围。采用正交实验来确定多频超声提取茶多酚的最佳提取工艺条件［21－25］。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

表1 正交实验因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.1.1 料液比对茶多酚提取率的影响 结果如图1所示:

图1 料液比对茶多酚提取率的影响Fig.1 The effect of material liquid ratio on the extraction rate of tea polyphenols

料液比取值范围为1∶20至1∶90g/mL。由图1可知，随着液体比例的增大，茶多酚提取率先增加后减少。这是因为茶多酚的溶出量随着液体比例的增加而增大，但是，液体比例增加到一定程度后，茶多酚溶出量增长变得缓慢，提取率反而下降。传统浸提料液比为1∶80g/mL时，提取率最大，为15.93%;超声提取料液比为 1∶70g/mL时，提取率最大，为24.10%。由此可看出，多频超声提取与传统溶剂提取相比，可以减少溶剂的使用量，节约溶剂，并且提取率较高。

2.1.2 提取时间对茶多酚提取率的影响，结果如图2所示。

图2 时间对茶多酚提取率的影响Fig.2 The effect of the extraction time on the extraction rate of tea polyphenols

提取时间的取值范围为10～80min。由图2可知，随着超声提取时间的延长，多频超声辅助提取茶多酚的提取率先增大后降低，超声提取20min时提取率便达到最大24.50%;传统浸提70min时，提取率最大17.85%。由此可看出，多频超声提取明显缩短了提取时间，这是由于超声波所具有的机械粉碎和空化效应等作用，增大了物质分子运动频率和速度，增加了溶剂的穿透力，提高茶多酚溶出速度和溶出数量，从而大大缩短了茶多酚的提取时间［26－27］。

2.1.3 温度对茶多酚提取率的影响，结果如图3所示。

图3 温度对茶多酚提取率的影响Fig.3 The effect of the extraction temperature on the extraction rate of tea polyphenols

温度的取值范围为35～95℃。由图3可知，在选定范围内，适当提高温度对茶多酚提取是有利的，提取温度的升高可以加快茶多酚的溶解。传统浸提法在70℃水温下提取率最大17.88%。超声提取在60℃时提取率最大24.63%。但过高的温度会加速茶多酚氧化，提取率反而有所下降。这是因为茶多酚是一种多羟基酚类物质，热稳定性不好，高温下加热时间一长易被氧化，导致一部分茶多酚丢失，另外，随着温度的继续升高，超声波的空化效应减弱，提取能力降低。

综合以上各个单因素实验可得:传统浸提的适宜条件是:料液比1∶80g/mL，时间70min，温度80℃，提取率最大为17.88%。

2.1.4 超声波功率对茶多酚提取率的影响，结果如图4所示。

图4 功率对茶多酚提取率的影响Fig.4 The effect of multi－frequency ultrasonic power on the extraction rate of tea polyphenols

超声波功率取值范围为100～1000W。由图4可知，超声波功率较小时，随着超声波功率的增大，茶多酚提取率也随之增大，200W时提取率最大24.63%，之后继续增大超声功率，提取率逐渐下降。这主要是因为超声功率增大，超声作用增强，使空化泡的运动比较剧烈;但是随着超声功率进一步增大，加速了提取液的流动，从而物料停留在超声场中的时间减少，破壁作用随之减弱，茶多酚溶出速率减小，再加上功率越大，产生的热效应越强可能破坏茶多酚的结构，使得有效的茶多酚含量减少。

2.1.5 循环速度对茶多酚提取率的影响，结果如图5所示。

循环速度取值范围为300～2100r/min。由图5的结果可以看出，随着循环速度的提高，茶多酚的提取率总体趋势随着转速的增加先升高后降低;1200r/min时，提取率最大为25.49%，其原因主要是由于电机的搅拌有利于茶叶颗粒的扩散，加速了茶多酚的溶出，从而提高茶多酚的提取率;而当转速过大时，易产生涡流，抑制了空化效应的产生，同时由于涡流卷入大量的空气，加剧茶多酚被溶剂中的溶解氧氧化，从而降低超声的提取效果，提取率反而下降。

表3 重复性实验结果Table 3 Repeatability on Multi－frequency Ultrasound－assisted Extraction of Tea Polyphenols from Green Tea

图5 循环速度对茶多酚提取率的影响Fig.5 The effect of cycle speed on the extraction rate of tea polyphenols

2.2 多频超声辅助提取茶多酚优化工艺研究

结果如表2所示。

表2 正交实验结果表Table 2 The multi－frequency ultrasonic－assisted extracting the result of orthogonal text

由表2可知，经过均值和极差分析与比较，在选定范围内，各因素对茶多酚提取率的影响顺序为:D＞E＞A＞B＞C（功率＞频率＞时间＞温度＞料液比）;最佳提取工艺条件为:超声提取（28kHz，200W），（33kHz，200W），（40kHz，200W），（60kHz，200W），提取时间20min，提取温度65℃，料液比1∶70g/mL，循环速度1200r/min。

2.3 验证实验

通过实验和分析，得出在最佳提取工艺条件下，多频超声波辅助法提取茶多酚的提取率和数据分析，见表3。

由表3可知，经过5次重复性实验，所得到的提取率平均值为25.69%，标准方差为0.35%，相对标准偏差为0.23%，结果表明在最佳工艺条件下，多频超声辅助提取茶多酚的重复性好。

3 结论

在规定条件下，采用单因素实验对多频超声辅助法提取茶多酚工艺的实验结果表明:随着料液比的降低，茶多酚提取率先增加后减少，超声提取料液比为1∶70g/mL时，提取率最大;随着超声提取时间的增大，多频超声辅助法提取茶多酚的提取率先增大后降低，超声提取20min时提取率便达到最大24.50%;在一定范围内，提取温度的升高可以加快茶多酚的溶解，但过高的温度会加速茶多酚氧化，提取率反而有所下降，在60℃时提取率最大;超声功率较小时，随着超声波功率的增大，茶多酚得率也随之增大，200W时提取率最大24.63%，之后继续增大超声功率，提取率逐渐下降;随着循环速度的提高，茶多酚的提取率总体趋势随着转速的增加先升高后降低，1200r/min时，提取率最大。

利用正交实验优化多频超声辅助法提取茶多酚工艺的实验方案表明，各因素对茶多酚提取率的影响顺序为:D＞E＞A＞B＞C（功率＞频率＞时间＞温度＞料液比）。多频循环超声辅助法提取比传统浸提提取率高，在最佳工艺条件下的茶多酚提取率分别为25.69%、17.88%。与传统的提取方法相比，多频循环超声辅助法提取的提取率提高了43.68%。多频超声辅助提取法提取茶多酚极大地提高了超声场的利用效率，保证了物料的均匀破碎，减少了局部过度破碎现象，充分发挥了超声波的空化效应、机械效应以及热效应在茶多酚提取方面的作用，即可促进细胞破碎、加快传质、加速反应，也可避免茶多酚在高温下长时间氧化，保证了茶多酚的提取质量并提高了效率［28－29］。

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