辣椒CaMAPK7 的全长cDNA 克隆及其表达分析

石兰平，杨 晟，申 磊，蔡金森，唐 倩，官德义，刘志钦，何水林

(1.福建农林大学生命科学学院;2.福建农林大学作物科学学院;3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州350002)

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是普遍存在于真核生物的信号传递蛋白，一般由多基因家族所编码，与MAPK 激酶激酶(MAP kinase kinase kinase，MKKK)和MAPK 激酶(MAP kinase kinase，MKK)组成MAPK 三级信号结联参与生物信号传递。在植物中已经发现MAPK 信号结联参与了植物激素、生物胁迫及非生物胁迫等过程的信号传导［1-4］。全基因组分析表明拟南芥、水稻、棉花和辣椒基因组中均含有20 个左右的MAPK［5-8］，目前仅对其中部分成员开展了结构、表达和功能分析。水稻中的OsMAPK5a 会在干旱、高盐以及低温下被激活，且在时空表达上存在差异［9］。棉花GhMPK2 受到真菌的诱导而表达并且在抗真菌中起着重要作用［10］;GhMAPK7 不仅在抗病中起作用，还可以促进种子的萌发［11］。大豆GMK1 在高盐作用下可以从细胞膜转移到细胞核并且在抗盐中起到关键作用［12］。迄今关于MAPK 家族成员的研究还仅限于少数物种中的少数成员，对大多数MAPK 家族成员的结构、表达和功能的认识还相当有限。

在我国辣椒作为一种重要的蔬菜和工业原料作物，拥有广大的播种面积，且产值居首位［13］，但具有较多的土传病害且是不耐连作的典型的茄科植物。在生产上，多种逆境尤其是病害的发生容易导致辣椒产量降低和品质劣化，因此，探索辣椒抗逆分子机制是其抗病抗逆遗传改良的重要基础研究工作。本研究以辣椒均一化cDNA 文库为模板，通过特异性引物PCR 扩增出CaMAPK7 的全长cDNA，荧光定量PCR 结果表明，CaMAPK7 在辣椒根、茎、叶中具有不同程度的组成型表达，而且其转录还受到病原菌、高温和几种外源激素的诱导表达，表明该基因可能在辣椒应答病原菌侵染和高温胁迫的信号交互作用中起重要的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

辣椒品种120#，由福建农林大学作物科学学院遗传育种实验室提供并保存。辣椒均一化文库为本实验室构建并保存，Prime ScriptTMRT-PCR Kit 反转录试剂盒SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)和RNA 提取所用的Trizol 均购自大连宝生物TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 CaMAPK7 基因的克隆以及序列分析 首先从辣椒基因组数据库中提取获得辣椒MAPK 家族中的所有成员(20 个)，找出其中的CaMAPK7，根据其5＇和3＇非翻译区设计特异性引物，再利用PCR 进行特异性扩增，获得其全长cDNA。

1.2.2 植物材料的处理 将辣椒种子在水中催芽后均匀播撒于盛有湿润培养基质的托盘中，置于25 ℃温室内培养，待其萌发至幼苗后，将其转移到小花盆中培养。辣椒长到6 叶期，选取长势良好，无病害，生长情况相对一致的辣椒苗进行激素、病原菌接种以及高温处理。(1)用100 μmol·L-1乙烯利(ET)、100 μmol·L-1水杨酸(SA)、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)分别对辣椒小苗进行处理。每小时用喷雾器对叶片均匀喷施激素一次，同时另以水作为对照。分别在处理后0、3、6、12、24、48 h 时进行采样，置于液氮速冻保存后放置于-80 ℃冰箱中，用于RNA 的提取。(2)以用42 ℃作为高温处理，以25℃处理作为常温对照。在处理后0、2、6、12、24 h 采样并低温保存用于提取RNA。(3)青枯菌接种处理。将本实验室保存的青枯菌活化后于SPA 培养基中培养至D600nm=0.8 时，用10 mmol·L-1MgC12重悬至D600nm=0.8，用无菌注射器注射辣椒叶片。在处理后0、3、6、12、24、48 h 时采样并保存，用于提取RNA。同时，采集该时期辣椒幼苗的根、茎、叶放置于-80℃冰箱中。用于提取RNA。

1.2.3 总RNA 的提取及RT-PCR 和qPCR 分析 采用Trizol 法提取辣椒叶片及其根、茎和叶等组织的总RNA，以TaKaRa 公司的RT-PCR Kit 反转录试剂盒反转录合成单链的cDNA 作为模板，用于RT-PCR 和qPCR 分析。设计1 对特异性RT-PCR 扩增引物F:5-TTGATAACCCAAGGGCTAAGGG-3 和R:5-AAGAGGAAACTGAGCGGGAAGA-3。PCR 体系为25 μL:10 ×Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 2 μL，Ex 酶0.2 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 17.3 μL。RT-PCR 反应程序为:94 ℃4 min;94 ℃1 min;60 ℃45 s;72 ℃1 min:35 个循环:72 ℃10 min。qPCR 分析采用实验室建立和采用体系进行。反应体系为10 μL:2 ×SYBR 5 μL，引物各0.2 μL，模板1 μL，ddH20 3.6 μL。反应程序为94 ℃5 s;94 ℃30 s，60 ℃34 s，40 个循环，重复3 次。

2 结果与分析

2.1 CaMAPK7 序列分析

从辣椒基因组中找到CaMAPK7(与拟南芥CaMAPK7 同源性最高)，根据其翻译起始密码子和终止子附近高度特异性序列设计引物，以辣椒均一化cDNA 文库为模板，经测序发现该PCR 产物含有1 个长度为1113 bp 开放阅读框，编码长度为370 个氨基酸残基的蛋白质，推导的分子量为42.7 ku，p I 为8.29。在功能结构域分析网站SMART 分析表明，该蛋白质氨基酸序列含有1 个长度为207 aa 的STK_c 保守结构域。通过在NCBI 上进行蛋白比对BLASTP，找到了该蛋白质与很多植物的MAPK 蛋白激酶具有很高的同源性，同源性在84% -97%之间(图1 -2)。值得指出的是，从辣椒120#上分离获得的CaMAPK7 碱基序列与网上公布的CM334 中的CaMAPK7 碱基序列完全一致。

图1 CaMAPK7 与其他植物MAPK 基因的同源比对Fig.1 Alignment analysis of CaMAPK7 with MAPKs from other plant species

图2 CaMAPK7 与其他植物MAPKs 进化树分析Fig.2 Phylogenetic analysis of CaMAPK7 with MAPKs from other plant species

2.2 CaMAPK7 在辣椒不同组织中的表达分析

分别提取健康辣椒植株根、茎、叶的RNA，反转录成cDNA 后，通过荧光定量PCR 检测了CaMAPK7 在这些组织中的表达情况。结果表明，CaMAPK7 在各个组织中均有不同程度的表达，在根的表达最高，其次是茎，叶片中的表达最低(图3)。

图3 CaMAPK7 在辣椒植株不同器官中的转录表达Fig.3 Transcriptional expression of CaMAPK7 in different organs in pepper plant

2.3 CaMAPK7 在青枯菌侵染、高温以及外源激素处理下的表达分析

2.3.1 青枯菌侵染 青枯病侵染下，12 h 后Ca-MAPK7 开始出现上调趋势，24 和48 h 出现了持续上调的趋势(图4A)。

2.3.2 高温处理 高温下，CaMAPK7 在2 h 开始出现上调趋势，12 h 上调达到了最高水平(图4B)。

2.3.3 外源激素处理 在MeJA 处理下，CaMAPK7在6 h 开始出现上调的趋势，而后12 -48 h 表现为持续上调(图5A);在SA 处理下，6 -48 h 都出现了上调的趋势，且12 h 达到了最高值(图5B);在ABA 处理下，CaMAPK7 的表达则出现了连续下调的趋势(图5C);在ET 处理下，CaMAPK7 在3 h 开始上调并且达到了最高值，而后6 -48 h 上调程度逐渐降低(图5D)。

图4 CaMAPK7 在辣椒中应答青枯病接种和高温胁迫处理的转录表达Fig.4 Transcriptional expression of CaMPAK7 in response to R.solanacearum inoculation and heat stress treatment in pepper plants

图5 CaMAPK7 在辣椒中应答几种外源激素处理的转录表达Fig.5 Transcriptional expression of CaMAPK7 in response to exogenous hormones

3 讨论

MAPK 信号转导系统是植物体重要的信号转导系统之一，不仅在植物抗逆过程中起着重要的作用，而且也参与了植物的生长发育［14-17］。然而，人们对大多数植物MAPK 家族成员的结构、表达和功能及其机制的认识还相当有限。

本研究以辣椒120#的均一化cDNA 为模板，利用CaMAPK7 特异性引物进行PCR 扩增获得其全长cDNA。根据测序结果，其序列与已公布的CM334 基因组中的CaMAPK7 序列一致，表明该基因在不同的辣椒品种中有较强的保守性。

在不同逆境下基因的表达模式一般与功能之间具有一致性。大量研究表明，植物抗病或抗逆反应具有诱导性特点，即受病原菌或逆境诱导表达［18-19］，这可能是植物历经进化过程中严酷的自然选择形成的生存策略。本研究表明，CaMAPK7 在辣椒不同组织中均有不同程度的表达，其中在根部的表达最强，说明CaMAPK7 可能参与了辣椒正常生理状态下的生长发育，但是，青枯菌侵染和高温处理，均可不同程度地诱导CaMAPK7 表达，表明CaMAPK7 除了可能参与植物生长发育调控外，可能还与辣椒应答病原菌和高温等逆境密切相关。鉴于CaMAPK7 的表达还可受外源SA、MeJA、ABA 和ET 处理的调控，表明CaMAPK7 介导的辣椒抗病或耐高温防御反应与这些激素介导的信号通路密切相关。大量研究表明，植物应答生物和非生物逆境胁迫的信号通路之间存在着广泛的交互作用(crosstalk)，Ca2+信使、活性氧、激素介导的信号通路、MAPK 结联、转录因子等参与了这些交互作用［20-24］，我们推测CaMAPK7 在辣椒应答高温和病原菌侵染的交互作用中也起着重要作用，有必要进一步开展研究予以证实。

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